Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

евертантов типа F+, из исходной чашки с агаром Penassay можно отобрать колонию, имеющую фенотип Hfr.

Метод отбора и посева штрихом

1. Делают посев Hfr-культуры для получения отдельных колоний в чашке с агаром Penassay.

2. Отбирают 10—20 колоний в отдельные пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм, содержащие по 2 мл бульона.

3. Инкубируют культуры при 37 °С в течение 4—б ч, пока их плотность не достигнет 2 ? 10s—5 ? 10s клетка/мл. В качестве контроля выращивают культуры штаммов типа F" и F+ например штаммы 5 и 7 (табл. 14.1).

4. Наносят штрихом 50—100 мкл выращенной в бульоне находящейся в логарифмической фазе культуры F~ штамма 13 ниже центра чашки с агаром, приготовленным на минимальной среде, селективной по отношению к трансконъюгантам типа Leu+Strr. Крышку чашки оставляют приоткрытой до тех пор, пока штрих не подсохнет. (При желании на одной чашке можно разместить два штриха.)

5. Сразу же наносят штрихи петлями, полными клеток Hfr, F~ и F+ так, чтобы эти штрихи пересекали штрих F~ (соблюдая осторожность, чтобы не коснуться

петлей стенок пробирки, что приведет к потере материала и разбросу результатов). Штрихам дают подсохнуть и инкубируют чашку при 37 °С в течение 24—48 ч.

6. Штрих культуры, состоящей преимущественно из клеток с фенотипом Hfr, даст в месте пересечения двух штрихов сплошной рост трансконъюгантов, в то время как штрих культуры, состоящей в основном из Р+-кле-ток, даст в месте пересечения лишь 5—10 обособленных колоний трансконъюгантов. При пересечении штрихов культур F~ и F~~, понятно, трансконъюганты вообще не выявляются.

Оба приведенных метода основаны на том, что клетки донора способны передавать свои хромосомы в присутствии стрептомицина (с несколько сниженной частотой), хотя в конечном итоге они погибают от стрептомицина на минимальном селективном агаре. Налидиксовую кислоту нельзя использовать в этой системе для негативного отбора против клеток донора, так как она вызывает немедленное прекращение переноса генетического материала донорами типа Nals.

Осуществление прерываемой конъюгации

Если необходимо, используют очищенный повторным выделением штамм Hfr и штамм F~. Проводят операции, описанные в этапах 1—5 в «Методе переноса плазмид F'» (разд. 14.3.1), с той разницей, что применяют минимальный агар, селективный по отношению к транс-конъюгантам типов Leu+Nalr, Pro+Nalr, Ade+Nalr, и методы разведения и посева, которые заключаются в следующем.

1. Через соответствующие интервалы времени (каждые 2, 3, 5 или 10 мин; для более частого отбора проб требуются два человека) 100 мкл смеси конъюгирующих клеток и 0,9 мл СБЖ, содержащего 50 мкг/мл налидиксовой кислоты, вносят в пробирки размером 13x100 мм при 37 °С.

2. Инкубируют эти разведения (10-1) при 37 °С в течение 30—40 мин, учитывая в момент отбора смеси, что за счет последующих разведений и посева время инкубации увеличивается примерно па 30 с.

3. Для каждого времени прерывания конъюгации высевают либо по 50 мкл смеси в две чашки с селективным агаром, либо 100 мкл в одну чашку. В табл. 14.2 приведены приблизительные величины окончательных разведений, высеваемых на каждый селективный агар, для разных значений времени прерывания спаривания. Эти величины соответствуют случаю, когда отношение числа клеток донора и реципиента равно 1:10, суммарная плотность смеси составляет 2 * 10s клетка/мл, используется чистая Hfr-культура, а условия для проявления фенотипа Hfr и для переноса Hfr-хромосом являются оптимальными.

6 Тнтр трансконъюгантов должен приближаться к максимальной ожидаемой частоте. Для некоторых или всех последующих времен прерывания конъюгации посевы можно ие делать.

4. Для определения титров чашки с агаром Penassay инкубируют в течение ночи при 37°С. Если штамм Hfr перед использованием не подвергался очистке повторным выделением, фракцию клеток Hfr можно определить на чашках с агаром Penassay одним из методов, описанных выше в «Определении стабильности фенотипа Шг».

5. Инкубируют чашки с минимальным селективным агаром двое суток при 37 °С. Колонии при подсчете не разрушают, а чашки оставляют, поскольку их можно использовать для определения наследования маркеров, по которым не велся отбор.

6. Рассчитывают частоты появления трансконъюгантов путем деления титра трансконъюгантов каждого типа и для каждого значения времени прерывания на титр клеток Hfr в смеси в начале конъюгации. Полученные данные можно использовать для построения графика, по которому определяют время поступления с хромосомой каждого из отбираемых Hfr-маркеров.

Анализ трансконъюгантов на наследование признаков, по которым отбор не производился

Иногда невозможно произвести отбор на наследование некоторых маркеров донора, или это трудно осуществить из-за большого числа маркеров, наследуемых в каждом конкретном случае. В связи с этим для оценки порядка расположения генетических локусов часто проводят более традиционный рекомбинационный анализ. Обычно это делают так: иглой или зубочисткой отбирают 100—200 колоний данного типа трансконъюгантов, клетки суспендируют в СБЖ и высевают штрихом на ту же селективную среду, чтобы получить очищенные обособленные колонии. Эти колонии можно затем нарастить в виде культур и использовать их для проверки генотипов путем посева штрихом на соответствующие среды или в виде пятна на подходящую агаровую среду с последующим анализом методом отпечатков. В последнем случае в исходной чашке должна находиться среда, селективная по отношению к фенотипу трансконъюганта, а среда в каждой чашке-копии должна помимо этой селективности обладать селективными свойствами в отношении тех или иных способностей или потребностей штамма в питательных веществах. Заранее ясно, что при таком подходе иногда не будет четких результатов, потому что порой не удается полностью очистить отбираемый тип трансконъюганта от родительских форм, существовавших до нанесения, в исходную чашку.

Поскольку перенос хромосом доноров Hfr-типа прерывается спонтанно, для четкого определения последовательности генов рекомбинантным анализом нужно, чтобы рекомбинанты, несущие заведомо известные маркеры, были протестированы на наследование близлежащих перенесенных маркеров. Так, в случае скрещивания штаммов 12 и 14 (табл. 14.1) отбирают 200—400 трансконъюгантов типа Trp+Nalr, очищают их и тестируют на наличие маркеров Hfr: ara+, leu+, tonA+, ргоА+, 1ас+, tsx+, ригЕ+ и galK+- Это делают следующим образом:

1. Культуры очищенных трансконъюгантов типа Trp+Nalr высевают в виде точек (50—100) в чашку на минимальный агар, селективный по отношению к этому типу. Инкубируют в течение ночи при 37 °С и последовательно перепечатывают в чашки с минимальным агаром, селективным по отношению к трансконъюгантам типов Ara+Trp+Nalr, Leu+Trp+Nalr, Pro+Trp+Nalr, Lac+Trp+Nalr, Ade+Trp+Nalr, Gal+Trp+Nalr. Последняя чашка представляет собой контроль, позволяющий убедиться в том, что клетки были действительно перенесены при перепечатывании в каждую из чашек.

2. Проверку устойчивости или чувствительности к фагам Т5 (tonA) и Т6 {tsx) точнее всего проводить посевом штрихов бульонных культур очищенных трансконъюгантов и пересекающихся с ними штрихов соответствующего фага в чашки со средой EMB0 (см. 2-й этап в «Характеристике свойств трансдуктантов», разд. 14.2.1). Следует, однако, иметь в виду, что такая операция очень трудоемкая; иногда достаточно точные результаты дает метод отпечатков. В последнем случае в чашки с агаром EMB0 вносят 50—100 мкл фаголиза-тов Т5 и Т6 (с концентрацией ~ 1010 ПОЕ/мл). Для каждого фага при перепечатывании с исходной чашки берут свой кусок бархата, так как перенос фага из одной чашки в другую может исказить результаты. Несмотря на то что мутация tonA обусловливает также устойчивость к фагу Т1, при обращении с этим фагом следует соблюдать особую осторожность и твердо придерживаться правил асептики. Фаг Т1 устойчив к высушиванию и обладает очень коротким латентным периодом. Именно из-за него не одна лаборатория вынуждена была свернуть исследования с применением Е. coli.

После того как установлен фенотип всех трансконъюгантов типа Trp+Nalr, можно подсчитать число реком-бинантов каждого класса и, исходя из него, получить расстояния между маркерами на генетической карте и их последовательность в Hfr-хромосоме.

Применение

Используя разнообразные родительские формы Hfr в отношении начала и направления хромосомного переноса при изучении конъюгации с помощью метода пересекающихся штрихов на агаре, для мутантного аллеля, выявляемого в реципиенте F", легко установить ориентировочное расположение аллеля дикого типа [4]. В целях более точной его локализации по отношению к другим генам можно использовать прерываемую конъюгацию с соответствующим штаммом Hfr. Однако, чтобы точно указать расположение этого локуса по отношению к ло-кусам, находящимся в непосредственной близости от него, может оказаться необходимой общая трансдукция, опосредованная фагом Р1, так как конъюгация часто не вполне подходит для этой цели.

14.4. СРЕДЫ И ШТАММЫ

Как правило, в работе по переносу генов используют самые обычные, имеющиеся в продаже среды. Ниже описаны только те из них, которые требуют модификации или дополнительных добавок. Приводятся также источники штаммов бактерий и фагов.

14.4.1. L-Бульон и L-arap [24]

Для приготовления L-бульона на I л воды берут 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl и 1 г глюкозы. рН раствора доводят до 7,0 добавлением перед автоклавированием приблизительно 1,7 мл 1 н. NaOH. L-arap —это L-бульон, содержащий 1,5% агара. Для получения сплошного лизиса в чашках с использованием бактериофага Р1 берут 1,2% агара. Мягкий L-arap содержит 0,65% сухого агара. Для экспериментов с такими фагами, как Р1, к L-средам добавляют СаСЬ до конечной концентрации 2,5 мМ, причем это делают после автоклавирования и охлаждения среды по крайней мере до 70 °С. Среды с СаСЬ не подлежат повторному автоклавированию, поскольку при автоклавировании в них может образоваться осадок. Обычно для работы готовят стерильный водный раствор 1 М СаСЬ.

14.4.2. Агар

страница 20
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.10.2019)