Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

готовят, как описано в гл. 15. Эту ДНК также фрагментируют с помощью ультразвука до величин мол. массы ~2,5-105.

Реакция с эндонуклеазой S1

Эндонуклеаза S1 с очень хорошей активностью имеется в продаже (Sigma, номер по каталогу 5255).

1. Готовят исходную реакционную смесь (назовем ее Sl-реакционной смесью): 0,125 мМ ZnS04, 87,5 мМ NaCI, 37,5 мМ Na-ацетатный буфер, рН 4,5, 25 мкг/мл ДНК (из тимуса теленка) — и хранят ее замороженной при —20 °С в аликвотах по 0,8 мл. В реакционную смесь при проведении эксперимента входит 0,8 мл Sl-реакционной смеси и 0,2 мл смеси для реассоциации. Конечные концентрации веществ в пробе составляют: 0,1 мМ ZnS04, 150 мМ NaCI (с учетом NaCI, внесенного с 0,2 мл смеси для реассоциации), 30 мМ Na-ацетатный буфер, рН 4,5, и 20 мкг/мл ДНК из тимуса теленка. Для каждой реакции реассоциации ставят две пробы с обработкой эндонуклеазой S1 и две пробы без обработки ферментом.

2. Добавляют 187,5 ед. акт, эндонуклеазы S1, чтобы запустить реакцию, и инкубируют 20 мин при 50 °С.

3. Останавливают реакцию, помещая пробирки со смесями в ледяную баню; в качестве соосадителя добавляют 50 мкг ДНК из тимуса теленка (в данном случае подходит любая имеющаяся в продаже не очень чистая ДНК) и 0,3 мл холодной 20%-ной ТХУ. Выпавший осадок собирают фильтрованием под вакуумом на мембранный фильтр (тип НА, Millipore Corp.). Фильтры высушивают при 70°С и определяют радиоактивность в сцинтилляционном счетчике. Контроли должны включать пробу с меченной in vivo плазмидной ДНК, по которой можно выявлять любое количество присутствующей в препарате нукдеазы, производящей двухцепочсчные разрывы; пробу, содержащую только денатурированную и реассоциированную меченую ДНК, которая служит контролем самореассоциации меченой ДНК в условиях опыта; пробу с денатурированной меченой ДНК, по которой судят об активности препарата эндонуклеазы S1. В табл. 15.3 показано, как обработать исходные данные по радиоактивности, чтобы получить процент гомологии ДНК. Результаты выражены в виде процентов необработанных контролей по отношению к величинам, полученным для гомологичной реакции.

15.3.5. Определение гомологии цепей ДНК с помощью электронной микроскопии

Если двум частично комплементарным цепям плазмидной ДНК дать возможность ренатурировать, то образуются гетеродуплексные молекулы, которые можно исследовать с помощью электронного микроскопа. Поскольку при электронно-микроскопическом анализе в случае соответствующего приготовления образцов одно-и двухцепочечные участки нуклеиновых кислот различаются, существует возможность картирования гомологичных и негомологичных участков. С тех пор как в практику вошли способы проверки с применением рестрик-таз и методы выявления гомологии ДНК в растворе по радиоактивности, методология гетеродуплексного анализа с помощью электронного микроскопа перестала широко применяться для анализа плазмидной ДНК- Хотя техника такого анализа требует большого экспериментального искусства и специального оборудования, она все же заслуживает рекомендации как способ точной локализации различий между плазмидами и наилучшей оценки организации плазмидной ДНКПо стандартной методике Кляйншмидта [18] к ДНК прикрепляют основной белок, и она переходит в образованный денатурированными белками монослой, создаваемый на разделе фаз вода — воздух. Одноцепочечная

ДНК сворачивается и на электронной микрофотографии имеет вид «куста». Однако в присутствии формамида одноцепочечные участки более или менее расправляются, и в этих условиях их можно увидеть и отличить от двухцепочечных. Таким образом, добавление формамида позволяет измерять одноцепочечные и двухцепочеч-ные участки ДНК и служит основой для анализа формирования гетеродуплексов из цепей плазмидных ДНК. Методику Кляйншмидта с успехом применяют для определения молекулярных масс плазмидной ДНК путем измерения длины контура хорошо расправленных раскрытых, кольцевых или линейных, двухцепочечных молекул плазмидной ДНК.

Если эксперименты по получению гетеродуплексов начинают с КЗК-ДНК, желательно ввести одноцепочеч-ный разрыв таким образом, чтобы при денатурации образовались две интактные молекулы — одноцепочечная линейная и одноцепочечная кольцевая. Этого достигают следующим образом: сначала отделяют КЗК-молекулы от всех других и затем производят слабую обработку дезоксирибонуклеазой или облучают видимым светом в присутствии бромистого этидия [3]. При такой слабой обработке образуются лишь одноцепочечные разрывы. КЗК-ДНК плазмид можно также расщеплять рестрик-тазами в условиях, когда расщепление происходит только по одному месту. Денатурацию обычно проводят прогреванием или обработкой щелочью. Способ, применяемый для денатурации ДНК, должен быть достаточно эффективным для того, чтобы привести к полному расхождению цепей, однако воздействие не должно быть настолько сильным, чтобы вызвать деградацию ДНК и внести дополнительные разрывы. Для ренатурации в водном растворе требуется высокая концентрация соли и нагревание до температуры примерно на 30 °С ниже температуры плавления (Тт). Однако и соль в высокой концентрации, и высокая температура могут привести к одноцепочечным разрывам. Поэтому ренатурацию лучше осуществлять с формамидом — растворителем, эффективно снижающим Тт. При этом пригодны достаточно разведенные растворы ДНК, а реакцию можно проводить при температуре, равной или ниже комнатной, в течение более длительного времени. Оптимальна ренаРис. 15.5. Образование гете-родуплекса между R-плаз-мидой R6K и ее делецион-ным мутантом RSF1040 [7]. Гетеродуплексные молекулы ДНК получали из ДНК двух плазмид, подвергавшихся одноцепочечному разрыву под действием рентгеновских лучей по методике, описанной в разд. 15.3.5. Петля слева представляет собой одноцепочечную (ss) ДНК плазмиды R6K, которая отсутствует из-за делеции в плазмиде RSF 1040. Большая петля справа — двухце-почечная ДНК (ds), по которой можно рассчитать область гомологии обеих плазмид. В данном случае двух-цепочечная область составляет около 70% ДНК плазмиды R6K.

турация приблизительно 50% взятой ДНК, так как продукты ренатурации смеси родственных молекул ДНК состоят из неренатурировавших одноцепочечных фрагментов, гомодуплексов или гетеродуплексов. Поэтому кинетика ренатурации такова, что по достижении 50—75%-ного уровня реассоциации происходит предпочтительное образование гомодуплексов, а не желаемых гетеродуплексов. На рис. 15.5 изображен типичный гетеродуплекс молекул плазмидной ДНК, имеющих одноцепочечный разрыв, и ее делеционной мутантной формы. Двухце-почечные и одноцепочечные области достаточно хорошо различаются.

В основе любого электронно-микроскопического анализа ДНК лежит приготовление мономолекулярного слоя нуклеиновой кислоты. Для этого на поверхности водного раствора создается пленка белка (цитохрома с). Денатурированный на поверхности белок образует нерастворимую пленку, которую можно рассматривать как мономолекулярный слой. ДНК адсорбируется на белко-вой пленке и вследствие этого переходит из трехмерной конфигурации в растворе в двумерную на пленке. Затем монослой с ДНК переносят в виде пленки на твердую подложку, покрывающую сетку для образцов, приготавливаемых для электронной микроскопии. Подложки обычно изготавливают из парлодия или производных нитроцеллюлозы.

Для улучшения контраста образец натеняют солями урана; применяется также натенение металлами, для того чтобы увеличить различие в контрастности между двухцепочечными и одноцепочечными участками ДНК. (Подробное описание методов электронной микроскопии см. в гл. 4.) Следует избегать чрезмерного натенения, поскольку при этом из-за неровностей подложки и слишком толстого слоя металла, напыленного на участках, представляющих собой фон, разница в контрасте между фоном и объектом и между одноцепочечными и двухцепочечными ДНК уменьшится. В литературе описаны разные методики [18] приготовления белкового монослоя (например, методика растягивания, диффузионная методика, методика «высвобождения в один этап»). В случае методики растягивания кювету наполняют соответствующей гипофазой и на ее поверхность под углом (например, с предметного стекла) наносят раствор с белком и нуклеиновой кислотой.

Для определения гомологии плазмидных ДНК при помощи электронной микроскопии рекомендуется следующий метод.

1. 0,1 мкг каждой из двух ДНК, взятых для образования гетеродуплексов, помещают в маленькую пробирку типа Eppendorf (West Coast Scientific Co., P. O. Box 2947, Rockridge Station, Oakland, CA 94618; номер no каталогу 3810). ДНК денатурируют добавлением 0,25 мл 0,1 М NaOH, 0,02 М Ыа2-ЭДТА и достаточного количества 10 М NaOH (1—5 мкл) до установления рН в пределах 12,4—12,6. Выдерживают ДНК в этом растворе при комнатной температуре в течение 10 мин.

2. Раствор нейтрализуют добавлением 25 мкл 1,8 М трис-НС1, 0,2 М трис-основания и 0,25 мл формамида (Mallinckrodt, 99%). Значение рН должно находиться между 8,4 и 8,6. Если это не так, то добавляют еще

2 мкл трис-буфера (при рН>8,6) или 2 мкл NaOH (при рН<8,4).

3. Позволяют денатурированной плазмидной ДНК ренатурировать в течение 1,5 ч. Для прекращения рена-турации раствор охлаждают до 0—4°С и диализуют против 0,01 М трис-HCI и 0,001 М ЭДТА, рН 7—8,5, при 4°С 2 ч. Раствор, в котором прошла ренатурацня, можно хранить при 4°С и отбирать из него пробы в любой момент в течение 1 мес, хотя ДНК в этом растворе продолжает ренатурировать даже при 4°С.

4. На этой стадии следует иметь подготовленную к работе кювету и все необходимое для спуска раствора на поверхность. Маленькая пластмассовая чашка Петри (например, чашка диаметром 50 мм для культуры тканей) хороша в качестве кюветы, а для наклонного спуска раствора на водную поверхность можно использовать предметные стекла для микроскопа. Стекла должны быть отмыты сначала кислотой, а затем раствором детергента, после чего их следует тщательно ополоснуть дистиллированной водой. Кюветы ополаскивают гипо-фазой, которая состоит из смеси 45 мл 0,01 М трис-НС1, 1,1 мМ ЭДТА, рН 8,5, и 5 мл 99%-ного формамида (Mallincrodt). Кювету наполняют гипофазой до обр

страница 27
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2019)