Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

Enzymol., 12B, 361—377 (1978).

19. Kupersztoch Y. M., Helinski D. R. A catenated DNA molecule as an intermediate in the replication of the resistance transfer factor R6K in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun., 54, 1451 — 1459 (1973).

20. Kupersztoch-Portnoy Y. M.} Lovett M. A., Helinski D. R. Strand and site specificity of the relaxation complex of the antibiotic resistance plasmid R6K. Biochemistry, 13, 5484—5490 (1974).

21. Lederberg J. Cell genetics and hereditary symbiosis. Physiol. Rev., 32, 403—430 (1952).

22. Manis J. J., Whitfield H. J. Physical characterization of a plasmid cointegrate containing an F his gnd element and the Salmonella typhimurlum LT2 cryptic plasmid. J. Bacteriol., 129, 1601—1606 (1977).

23. Myers J. A., Sanchez D., Etwelt L. P., Falkow S. A simple agarose gel electrophoretic method for the identification and characterization of plasmid deoxyribonucleic acid. J. Bacteriol., 127, 1529—1537 (1976).

24. Palchaudhuri S. Molecular characterization of hydrocarbon degra-dative plasmids in Pseudomonas pufida. Biochem. Biophys. Res. Commun., 77, 518—525 (1977).

25. Radloff R., Bauer W., Vinograd J. A dye buoyant density method for the detection and isolation of closed circular duplex DNA: the closed circular DNA in HeLa cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 57, 1514—1522 (1967).

26. Sharp P. A., Hsu M. Т., Ohtsubo E., Davidson N. Electron microscope heteroduplex studies of sequence relations among plasmids of Escherichia coli. I. Structure of R-prime factors. J. Mol. Biol., 71, 471—497 (1972).

27. Skurrey R. A., Nagaishi H., Clark J. Molecular cloning of DNA from F sex factor of Escherichia coli K-12. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 73, 64—68 (1976).

28. Southern E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol., 98, 503—517 (1975).

29. Thompson R., Hughes S. G., Broda P. Plasmid identification using specific endonucleases. Mol. Gen. Genet., 133, 141—149 (1974).

30. Watson В., Currier Т. C, Gordon M. P., Chilton M.-D., N ester E. W. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J. Bacteriol., 123, 255—264 (1975),

Часть IV

МЕТАБОЛИЗМ

ВВЕДЕНИЕ

В. Вуд

Метаболическая активность бактериальных клеток представляет собой организованную и регулируемую последовательность ферментативных процессов синтеза и распада, ответственных за поддержание, рост, движение и репродукцию микроорганизмов. Эти функции осуществляются за счет источников энергии и других питательных веществ внутри- и внеклеточного происхождения. Метаболические системы, лежащие в основе указанных функций, изучают с помощью разнообразных биологических, физических, химических и ферментативных методов. Биологические методы, применяемые главным образом для изучения пищевых потребностей и генетики микроорганизмов, описаны в других разделах этого руководства.

В данном разделе рассматриваются физические, химические и ферментативные методы, которые используются при исследовании метаболизма бактерий. В последующих главах описаны физические методы и приборы, фракционирование и анализ химических компонентов, выделение и количественное определение ферментов, изучение катализируемых ими реакций, а также исследование проницаемости клеток и транспортных процессов. Все эти вопросы разработаны настолько хорошо, что вполне оправданно опубликование специальных книг, посвященных их методологии и применению. Однако в данном случае авторы ограничились описанием только самых надежных и простых методов, которые могут использовать для достаточно основательного изучения метаболизма бактерий даже начинающие исследователи.

Глава 16

ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В. Вуд

Эта глава включает материал по основным физико-аналитическим методам и процедурам разделения: фотометрии, ионселективным электродам, хроматографии, измерению радиоактивности, гель-электрофорезу и ма-нометрии. Их использование в бактериологии во многих случаях сыграло важную роль и стало почти характерной чертой этой области науки. В настоящем руководстве приводится общее описание как достоинств, так и слабых сторон методов, специальных методик, прописей, а также примеров их применения в исследованиях бактерий.

В этой главе особенно необходимо ограничиться описанием простых процедур, пригодных для лабораторных занятий или представляющих ценность на начальных этапах научных исследований, поскольку более глубокое изложение каждого вопроса можно найти в книгах, специально посвященных какому-то одному методу. Некоторые методы здесь вообще не рассматриваются или упоминаются лишь кратко; среди них тонкослойная хроматография, седиментационный анализ макромолекул и различные типы электрофореза. В то же время в этой главе приведена информация, мало известная бактериологам.

16.1. ФОТОМЕТРИЯ

В научных и практических исследованиях по бактериологии широко применяются самые разнообразные фотометрические методы, в том числе абсорбционная фотометрия, флуориметрия и нефелометрия, а также абсорбционная и эмиссионная фотометрия пламени и методы ядерного магнитного и электронного парамагнитного резонанса [1, 2]. Все эти методы позволяют идентифицировать соединения, устанавливать их структуру, определять концентрации веществ и скорости реакций.

16.1.1. Абсорбционная фотометрия

С помощью спектрофотометров для измерения поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра определяют способность растворенных веществ поглощать свет при определенных длинах волн. График, на котором поглощение света отложено против длины волны (спектр поглощения), помогает идентифицировать соединения и дает информацию о структуре хромофоров. Количество света, поглощенного измеряемым веществом при той или иной длине волны, позволяет определять его концентрацию, а изменение поглощения во времени — скорости реакций.

Имеющийся в приборе монохроматор выделяет из всего спектра источника света излучение в узком диапазоне длин волн и направляет его через образец к фотометру, в котором количество поступающей энергии измеряется и выражается в виде отношения интенсивности пропущенного света (1Т) к интенсивности падающего света (/о). Если /0 принять за 100, то измеренная величина является пропусканием, выраженным в процентах (%Т). Значение %Т связано с величиной молярной концентрации (С) поглощающего вещества в соответствии с законом Ламберта — Бэра:

— lg %Т=в.ЬС=А1\

'> В этой формуле допущена ошибка. На самом деле Т выражается не в процентах, а в долях единицы. Поэтому А=—lgT. Основной закон поглощения часто называют также законом Бугера—Ламберта—Бэра или просто законом Бэра. — Прим. ред.

2) В отечественной литературе вместо термина «поглощаемость> (Л) принят термин «оптическая плотиость> (D), которым мы и будем здесь пользоваться. — Прим. ред.

где s—молярный коэффициент поглощения образца при заданной длине волны, а / — длина пути света в сантиметрах. Поскольку ей/ — постоянные величины, С пропорциональна отрицательному логарифму % Т или прямо пропорциональна поглощаемости (Л)2). Поэтому более поздние модели спектрофотометров с линейной шкалой для А более приспособлены для точных измерений образцов со средними или большими значениями оптической плотности.

Факторы, влияющие на качественные характеристики

Качество лабораторных спектрофотометров определяется следующими факторами: монохроматичностью света, падающего на образец, интенсивностью и площадью светового пучка (числовая апертура), точностью калибровки по длинам волн, точностью калибровки фотометра, линейностью показаний фотометра, шумом, а также инерционностью и стабильностью нулевой линии. Повышение качества приборов достигается иногда в результате увеличения их размеров и стоимости. Однако при проведении биологических экспериментов предпочтительнее до предела использовать все возможности имеющегося в наличии простого прибора, а не уповать на приобретение спектрофотометра высокого класса.

Влияние спектральной ширины полосы

Спектральная чистота света, пропускаемого монохро-матором при номинально указанной длине волны, или, иными словами, естественная ширина полосы, — это ее ширина в нанометрах, измеренная на половине высоты максимума энергии излучения (рис. 16.1,7). Эта ширина полосы указана для каждого прибора, и ее трудно определить в лабораторных условиях без узкополосного (^1 нм) интерференционного фильтра. У монохрома-торов, у которых диспергирующим элементом служит решетка, ширина полосы достаточно постоянна в пределах данного диапазона длин волн, однако у призмен-ных монохроматоров ширина полосы меняется с длиной волны. В обоих случаях ширина полосы зависит от ширины щели. Точность измерения оптической плотности при условии, что нет рассеянного света (см. ниже), зависит от отношения спектральной ширины поло-сы (характеристика прибора) к естественной ширине полосы, т. е. к ширине в нанометрах на половине высо

ты максимума поглощения образца (характеристика хромофора в растворе) (рис. 16.1,//). Так, с помощью недорогого спектрофотометра, имеющего при 340 нм спектральную ширину полосы 8 нм, можно измерить оптическую плотность образца с естественной шириной полосы 80 нм (величина отношения равна ОД) с точностью 99,5% [4]. В случае хромофора с естественной шириной полосы 50 нм при спектральной ширине 8 нм достигается точность измерения 99%. Восстановленный нико-тинамидадениндинуклеотид (NADH), соединение, наиболее часто анализируемое при 340 нм, имеет при этой, длине волны естественную ширину полосы 58 нм. Отсюда ясно, что NADH можно измерить с помощью недорогого спектрофотометра с более чем 99%-ной точностью [4].

Влияние рассеянного света

Еще одно следствие широкополосности или низкой спектральной чистоты света — это повышение доли рассеянного света, т. е. излучения, отличающегося по длине

волны от указанного на шкале и выходящего за пределы спектральной ширины пропускания прибора. Поскольку спектральная ширина пропускания призменных монохроматоров зависит как от ширины щелей, так и от длины волны, от них зависит также и примесь рассеянного света. Ра

страница 29
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.09.2019)