Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

склонность к множественным мутациям

Соединения могут оказаться труднодоступными

Особенно эффективны при излечивании клеток от плазмид

Очень эффективен в излечивании клеток от плазмид

4. Обработанную суспензию центрифугируют и осадок ресуспендируют в равном объеме минимальной среды М56 (разд. 13.9.8).

5. Суспензию вновь центрифугируют и осадок ресуспендируют в минимальной среде М56 (разд. 13.9.8). Этот метод, предложенный Эделбергом и др. [5], дает большой процент мутантов без излишней гибели клеток, имеющей место в богатой жидкой среде (по крайней мере для Е. coli). Особенно эффективен этот метод для получения ауксотрофных мутантов (разд. 13.6.2).

Возможные трудности

Предупреждение. НТГ не только мощный мутаген, но и мощный канцероген! Поэтому всегда необходимо руководствоваться правилами, указанными в конце разд. 13.2.

Можно построить кривую гибели клеток под действием НТГ; для этого высевают разведения 10~6 культуры, обработанной НТГ в течение разных отрезков времени с интервалом 5 мин, и исходной необработанной культуры [4]. Условия, в которых проводится обработка НТГ, не должны приводить к гибели более чем 50% клеток — при повышении концентрации НТГ клеток погибнет больше, но среди выживших до 40% увеличится выход ауксотрофов [5].

Одна из потенциальных трудностей в работе с этим мутагеном заключается в том, что он может индуцировать множественные мутации в ограниченном участке бактериальной хромосомы [12]. У таких мутантов были бы очень сложные требования к питательной среде, так как их мутации затрагивали бы метаболические функции более чем одного типа; к тому же такие мутанты не могут ревертировать к дикому типу с ожидаемой частотой. Поэтому, прежде чем продолжать работу с мутантами, индуцированными НТГ, следует проверить возможность их реверсии к дикому типу (разд. 13.5.2).

13.2.3. Аналоги оснований

Аналоги оснований, включенные в молекулу ДНК, такие, как 5-бромурацил и 2-аминопурин, вызывают ошибки репликаций. Указанные аналоги могут существовать в двух таутомерных формах—обычной кето-, или аминоформе, и реже встречающейся енольной, или ими-ноформе. Каждая из форм имеет свою специфичность в отношении спаривания с другими основаниями. Поэтому переход в более редко встречающуюся таутомерную форму может привести к неправильному образованию пар во время репликации ДНК. Поскольку ошибки в образовании пар могут возникать на двух различных стадиях (в момент включения аналога и во время последующей репликации), они могут приводить к транзици-ям в обоих направлениях: GC—кАТ и, наоборот, AT—>-GC. Однако показано, что и 5-бромурацил, и 2-аминопурин более эффективно вызывают транзиций типа AT—>GC, чем GC—*АТ [10, 22]. Ни один из этих агентов не имеет большого значения в масштабных работах по мутагенезу ввиду их низкой мутагенной активности. Последнее обусловлено, видимо, неспособностью указанных аналогов конкурировать с нормальными нук-леотидами. Зато эти аналоги полезны при изучении обратных мутаций, где чувствительность метода в отношении выявления редких мутаций высока (разд. 13.5.2).

Обработка 5-бромурацилом

Чтобы добиться существенного мутагенеза при действии 5-бромурацила, необходимо снизить внутриклеточную концентрацию тимина — природного аналога 5-бромурацила. Это можно осуществить с помощью мутанта, нуждающегося в экзогенном тимине, или предварительной обработкой клеток веществами, ингибирующими синтез тимина и тем самым снижающими уровень содержания в клетке самого тимина и его нуклеотидных и нуклеозидных производных. Тимин в норме синтезируется из дезоксиуридина при участии фермента тими-дилатсинтетазы. В присутствии сульфаниламида — ингибитора синтеза фолиевой кислоты — в растущих клетках происходит истощение донора метильных групп и как следствие уменьшение содержания тиминовых нуклео-зидов и нуклеотидов.

1. Клетки соответствующего бактериального штамма выращивают в течение ночи в минимальной среде (разд. 13.9.8 или 13.9.15), если по синтезу тимина он относится к дикому типу (тиминнезависимый штамм), или в минимальной среде с тимином (20 мкг/мл), если штамм дефектен по синтезу тимина (тиминзависимый штамм).

2. Для тиминнезависимых штаммов культуру разводят 1 :25 в бульоне с сульфаниламидом (разд. 13.9.5), содержащем 50 мкг 5-бромурацила в 1 мл.

3. Инкубируют на качалке 5—6 ч при 35—37 °С.

4. Культуру центрифугируют (или фильтруют через бактериальный фильтр) и ресуспендируют клетки в свежей среде, состав которой способствует обогащению и (или) отбору, требуемым для получения мутанта желаемого типа.

2а. Культуру тиминзависимого штамма после инкубации в течение ночи центрифугируют, клетки ресуспендируют в минимальной среде (разд. 13.9.8 или 13.9.15),

ие содержащей тимина, но имеющей в своем составе

кислый гидролизат казеина (0,1%) и 20 мкг/мл 1-триптофана. )

За. Проводят инкубацию 20—30 мин при слабом покачивании для полной утилизации клетками остатков тимина в среде.

4а, Добавляют 5-бромурацил до конечной концентрации 20 мкг/мл и продолжают инкубацию с покачиванием еще в течение 1 ч.

5а. Чтобы удалить 5-бромурацил, культуру центрифугируют или фильтруют и клетки ресуспендируют в среде, содержащей 20 мкг/мл тимина, во избежание их гибели от недостатка тимина во время дальнейшего роста и (или) процедур отбора.

Обработка 2-аминопурином

1. Клетки исследуемой бактерии выращивают в течение ночи в L-бульоне (разд. 13.9.1) или питательном бульоне (разд. 13.9.11).

2. Культуру разводят свежим бульоном, содержащим 500 мкг/мл 2-аминопурина, до плотности 102—103 клеток в 1 мл.

3. Проводят инкубацию на качалке до тех пор, пока культура не становится мутной. Это длительный этап, во время которого происходит рост клеток и экспрессия индуцированных мутаций. При желании непосредственно вслед за ним можно приступить к обогащению культуры по тому или иному мутанту. Если же необходимо получить сразу много независимых мутантов, следует поделить культуру на несколько пробирок еще на этапе добавления 2-аминопурина и затем из каждой отбирать лишь один определенный мутант.

13.2.4. Соединения группы ICR

Соединения этой группы [acridine half-mustards, обозначаемые также номером с акронимом ICR, происхождение которого связано с изучением этих веществ в Институте исследований рака (Institute for Cancer Research), находящемся в Филадельфии, шт. Пенсильвания] обладают мутагенным действием, обусловленным их ин-теркаляцией в молекулу ДНК между основаниями, образующими пары в двойной спирали.

Интеркаляция в свою очередь приводит к вставке или делеции нуклеотидов во время последующей репликации. В результате происходят мутации сдвига рамки, при которых в транскрибируемой молекуле мРНК закодированная информация, подлежащая трансляции, имеет сдвиг в рамке считывания. При этом нарушается последовательность аминокислот за участком вставки или делеции. Обычно сдвиг рамки ведет к появлению бессмысленного кодона (нонсенс-кодона), и поэтому фенотипически мутанты в данном случае сходны с нонсенс-мутантами, образованными в результате замены оснований: в обоих случаях функция, затрагиваемая мутацией, полностью нарушается.

Методика

1. Активно растущую культуру, выбранную для обработки мутагеном, разводят до концентрации 104 клетка/мл минимальной средой (разд. 13.9.8), содержащей 5—10 мкг/мл ICR-191 (поставляется фирмой Polysciences, Inc., Warrington, PA 18976).

2. Выращивают культуру до концентрации клеток, для которой светорассеяние составляет 100 ед. при измерении в колориметре Клетта — Саммерсона с использованием красного светофильтра (разд. 11.4.1). Это соответствует приблизительно 10—12 циклам деления в присутствии мутагена.

3. Делают посев разведений для отбора мутантов или предварительно обогащают культуру.

Возможные трудности

Перед обработкой мутагенами группы IRC целесообразно изучить рост данной бактерии в средах с возрастающей концентрацией мутагена. Для эксперимента по мутагенезу следует выбрать такую концентрацию, при которой культура еще может медленно расти (время генерации приблизительно вдвое превышает нормальное); в этом случае наблюдается оптимальная корреляция между торможением роста и мутагенной активностью. Это предшествующее опыту определение важно при изучении бактерий с различной степенью дефектности рекомбина-ционной и репарационной систем, так как они могут быть слишком чувствительны к мутагену. Соединения рассматриваемой группы могут усилить индукцию мутаций светом, поэтому, если поставлена цель — получить мутации только сдвига рамки, опыты следует проводить в темноте.

13,2.5. Азотистая кислота

Азотистая кислота, относящаяся к химическим мутагенам, вызывает главным образом транзицни в обоих направлениях за счет дезаминирования цитозина и аде-нина. Кроме этого, по неизвестному механизму она со значительной частотой индуцирует делеции.

Методика

1. Культуру, предназначенную для мутагенеза, в течение ночи выращивают в 5 мл L-бульона (разд. 13.9.1) или питательного бульона (разд. 13.9.11). Для сбора клеток культуру центрифугируют при 5000 g 5 мин.

2. Осадок промывают 5 мл стерильного 0,1 М Na-ацетатного буфера, рН 4,6 (разд. 13.9.6).

3. Готовят свежий раствор азотистой кислоты (0,05 М нитрит натрия в 0,1 М Na-ацетатном буфере, рН 4,6).

4. Промытые клетки ресуспендируют в 1 мл азотистой кислоты и инкубируют 10—20 мин при 30—37 °С без встряхивания.

5. Для остановки реакции добавляют 10 мл минимальной среды (разд. 13.9.8 или 13.9.15).

6. После центрифугирования суспензии при 5000 g в течение 5 мин осадок ресуспендируют в среде, пригодной для дальнейшего выращивания и выявления желаемого типа мутантов. Поскольку обработка азотистой кислотой вызывает гибель значительного числа клеток, следует определить степени выживания клеток путем посева приблизительных разведений на питательный агар (разд. 13.9.12) до и после обработки. Оптимальная степень выживания находится в пределах между 0,1 и 0,01%.

13.2.6. Алкилирующие агенты

Алкилирующие агенты, такие, как этилметансульфо-нат (ЭМС), диэтилсульфат, метилметансульфонат, модифицируют в ДНК преимуще

страница 3
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.12.2019)