Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

ратов, определение стандартного отклонения от среднего значения и стандартной ошибки. Хотя линейность — это весьма желательное условие, можно использовать также и нелинейную хорошо воспроизводимую калибровочную кривую, находя величины прямо из графика.

Определение концентрации частиц [6]

Фотометрическое определение концентрации частиц в суспензии зависит от степени ослабления светового пучка в результате рассеяния света. В предназначенном для такого определения нефелометре имеется высокочувствительный фотометр с фотодетектором, расположенным под углом 90—160° к падающему световому пучку. Фотометрический сигнал не подчиняется закону Ламберта — Бэра, тем не менее при очень низких концентрациях частиц, которые можно измерить с помощью нефелометра, но не фотометра, измеряющего пропускание, сигнал бывает почти линейным. Для измерения более высоких концентраций частиц можно также использовать спектрофотометры и колориметры, но такой метод основан на определении ослабления падающего светового пучка. В приборах обоих типов получают калибровочную кривую зависимости сигнала от концентрации бактериальных клеток (см. разд. 11.4).

Определение скоростей реакций

Если реагирующее вещество или продукт реакции представляет собой хромофор, скорость его потребления или образования можно определить, измеряя оптическую плотность при фиксированной длине волны через те или иные промежутки времени или следя за изменением поглощения во времени с помощью самописца. Скорость реакции можно определить по наклону кривой зависимости оптической плотности от времени. Для этой цели разработаны специальные спектрофотометры и приставки к стандартным спектрофотометрам. Некоторые из них, специально предназначенные для определения скоростей реакций, катализируемых ферментами, регистрируют величины оптической плотности непосредственно на бумаге самописца, что дает возможность следить одновременно за протеканием нескольких реакций.

16.1.2. Флуориметрия

Флуоресценция — это испускание света флуорофо-ром, который поглощает свет при меньшей длине волны. Поскольку измерение основано на сравнении энергии излучения в измеряемой пробе с очень низким уровнем излучения в контрольном образце, отношение сигнала к шуму очень высоко и, следовательно, флуориметричес-кие измерения более чувствительны, чем абсорбционные. Например, определение NADH, основанное на флуоресценции, приблизительно в 100 раз чувствительнее, чем спектрофотометрический метод. Интенсивность флуоресценции зависит как от концентрации флуорофо-ра, так и (в отличие от поглощения) от интенсивности возбуждающего излучения. Поскольку возбуждение и излучение флуоресценции возникают при различных длинах волн, прибор должен быть устроен так, чтобы энергия возбуждения не доходила до фотодетектора. Это обычно достигается путем помещения детектора под углом 90° к световому пучку, возбуждающему излучение. Светорассеяние как в растворе, так и от поверхности может создавать большие трудности, но его можно свести к минимуму с помощью граничных фильтров с «крутым» фронтом, пропускающих энергию флуоресценции, но задерживающих энергию возбуждения.

Поскольку интенсивность флуоресценции зависит от интенсивности возбуждающего света, первостепенное значение имеют характеристики излучения лампы и стабильность ее работы. В некоторых приборах интенсивность возбуждающего света регулируется с помощью второго фотодетектора, при этом определяется отношение интенсивности флуоресценции к интенсивности возбуждающего света.

1> Интенсивность флуоресценции пропорциональна поглощению образца (1—Т), а не пропусканию (Т) —Прим. ред

При низких интенсивностях флуоресцентного излучения выходное напряжение фотодетектора почти линейно зависит от интенсивности, следовательно, концентрация флуорофора пропорциональна эквиваленту пропускания1, а не оптической плотности, как при абсорбционной фотометрии. Концентрацию флуорофора можно определить, измеряя относительную флуоресценцию. Определение заключается в основном в приготовлении контрольного растворителя и набора стандартных растворов, построении стандартной кривой и сравнении с неизвестными образцами. Поскольку чувствительность этого метода выше, вероятность влияния артефактов на результаты измерения больше, чем при абсорбционной фотометрии.

Нестабильность прибора

Необходимо проверять или предотвращать флуктуации возбуждающего света, возникающие из-за нестабильности лампы. Могут оказаться необходимыми частые повторные измерения чистого растворителя и стандартов.

Поглощение растворов

Высокая оптическая плотность растворов приводит к ошибкам двух типов: 1) реабсорбции энергии флуоресценции, заметно снижающей выход флуоресценции, и 2) неодинаковой интенсивности па передней излучающей поверхности в приборах, в которых регистрация производится под прямым углом. Это происходит в результате изменений интенсивности возбуждающего света, обусловленных высокой оптической плотностью измеряемого раствора при длине волны возбуждения. Поэтому оптическая плотность не должна превышать 0,2 и независимые измерения оптической плотности стандартных растворов и исследуемых образцов следует проводить при длинах волн возбуждения и излучения.

Флуоресценция примесей

Нижний предел чувствительности определяется флуоресценцией фона, которая снижается до минимума при использовании чистых реактивов. Кроме того, ошибки могут возникать из-за неодинакового загрязнения образцов и стеклянной посуды различными флуоресцирующими материалами, в том числе резиной, жирами, отпечатками пальцев и экстрактами из фильтровальной бумаги или диализной трубки. Мутность также увеличивает вероятность ошибки из-за рассеяния света, измеряемого как флуоресценция. Таким образом, стеклянную посуду» в которой проводятся измерения и хранятся растворы, необходимо содержать в абсолютной чистоте. Многие из упомянутых выше эффектов можно свести к минимуму, применяя защитные фильтры перед фотоумножителями.

Порча образцов и другие артефакты

Образцы могут портиться до или во время измерения. Довольно часто происходит фотохимическое разложение исследуемых соединений и их адсорбция на стеклянных поверхностях, что особенно касается макромолекул. Первое из этих двух явлений может проявляться в виде ослабления флуоресценции с течением времени, а о наличии второго свидетельствует явное запаздывание изменения флуоресценции при увеличении концентрации образца или флуорофора.

Влияние температуры

Поскольку явления, связанные с флуоресценцией, зависят от температуры, все измерения следует проводить при постоянной температуре, предпочтительно в термо-статируемой кювете.

16.2. ИОНСЕЛЕКТИВНЫЕ ЭЛЕКТРОДЫ Уравнение Нернста

*-*.+ ?• Чёт

можно применять при измерении концентрации (активности) или отношения концентраций некоторых молекул или ионов. Е — измеряемый потенциал, Eq — стандартный потенциал электрода, = 8,314 Дж/(моль*/С), Т — абсолютная температура, п — число электронов, F== = 96 500 Кл/(г-экв.), а [Ох.] и [Red.]—концентрации соответственно окисленных и восстановленных форм вещества.

Это фундаментальное уравнение электрохимии дает возможность определять ряд биологически важных ионов, например водорода, кислорода, аммония, хлора и многих других веществ. Использование данного уравнения при разработке прибора предполагает наличие в нем: 1) измерительного электрода, способного улавливать потенциал, создаваемый окислительно-восстановительной парой, 2) стандартного полуэлемента с известным потенциалом и 3) электрометра или потенциометра, измеряющего напряжение между двумя полуэлементами. Решение уравнения Нернста для измеряющего полуэлемента вытекает из отношения

Е (измеряющий полуэлемент) =E-\-EQ.

Возможность определять тот или иной ион зависит от конструкции измеряющего электрода. Например, стеклянный электрод создает потенциал, пропорциональный концентрации ионов водорода, а некоторые ион-селективные электроды создают потенциалы для специфических ионов, так как мембрана или твердый материал, изолирующий металлический электрод от среды, является ионселективным. Существует много других подходов к определению концентрации различных ионов, основанных на свойствах электродов. Например, измерение кислорода с помощью электрода представляет собой один из видов полярографии, поскольку для ионизации кислорода необходимо поляризующее напряжение.

16.2.1. Электрод для измерения ионов водорода

Стеклянный электрод является практически единственным средством измерения активности водородных ионов. Тонкая мембрана из специального стекла отделяет хлорсеребряный полуэлемент от измеряемого раствора [П]. Электрический потенциал стеклянного электрода изменяется линейно в зависимости от рН в широком диапазоне значений рН — от 1 до 11. В области рН 11 и выше линейность показаний наблюдается только в том случае, если применяется специальное устойчивое к щелочи стекло. В качестве электрода сравнения используют стандартный каломельный (Hg2Cb) полуэлемент, соединенный с измеряемым раствором с помощью солевого мостика (КС1). Оба электрода — стеклянный и стандартный — погружают в раствор образца или объединяют их в один комбинированный электрод, который можно вводить в длинные пробирки или приспособить для измерения очень малых объемов образцов.

Кроме статического определения рН образцов рН-метр или его автоматический вариант (рН-стат) позволяет следить за ходом реакций, в которых участвует пли потребляется ион водорода. В этом случае для поддержания постоянного рИ добавляют щелочь или кислоту; кривая потребления кислоты или щелочи, отложенного против значений времени, отражает развитие реакции. Ферментативное или химическое окисление глюкозы или глюкозо-6-фосфата, фосфорилирование субстратов при участи аденозинтрифосфатов и соответствующих киназ, а также гидролиз белков протеазами — все это примеры реакций, которые можно проследить с помощью стеклянного электрода.

Калибровка рН-метра

Прибор следует откалибровать с помощью буферных растворов с известными значениями рН. Для этой цели часто применяют готовые жидкие или твердые буфер

страница 31
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2019)