Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

щее

\ / \ч ; УРКОНЕЧНАЯ

количество (носитель плюс неизвестное вещество) (г)Х~Ггп •

<У ^ИСХОДНАЯ

Метод двойного изотопного разбавления с успехом используется для выделения очень малых количеств веществ, например для извлечения стерола из какого-нибудь гомогената с помощью многоэтапной процедуры, приводящей лишь к частичному выходу очищенного соединения. К гомогенату можно добавить 14С-стерол с известной общей радиоактивностью. Выход стерола на последнем этапе очистки определяется по общей ^-радиоактивности выделенного очищенного соединения. Согласно другой методике, получают какое-либо производное стерола, проводя соответствующую реакцию либо в неочищенном экстракте, если это удобно, либо на одном из самых ранних этапов очистки. Например, для получения ацетилового эфира стерола можно использовать уксусный ангидрид, меченный 3Н. По содержанию 3Н в выделенном материале определяют исходное количество стерола. Для этого необходимо знать только удельную радиоактивность уксусного ангидрида. Итак,

Радиоактивность выделенного стерола (имп/мин) Выход стерола — радиоактивность добавленного стерола (имп/мин)'

Количество 3Н соединения (мкмоль)

Количество стерола (мкмоль) = Выход =

УР уксусного ангидрида (мкКи/мкмоль)

~~ Выход

1 мкКи = 2,22 106 расп./мин.

Определение необходимого количества радиоизотопа

Как правило, суммарная радиоактивность должна в умеренной степени (вдвое) превышать минимум, необходимый для определения конечной или самой низкой активности образцов. Это позволяет избежать вредного влияния радиации и загрязнения лабораторного оборудования, а также максимально повысить уровень безопасности при проведении экспериментов. Проще всего, естественно, при расчетах исходить из радиоактивности, указанной в опубликованных работах, в которых описаны подобные эксперименты, внеся в эти расчеты соответствующие поправки на изменение объемов, характериРадиоактивность 3Н-соединения (имп/мин)/Эффективность счета стик приборов и т. д. Если это невозможно, следует начать с минимальной скорости счета, дающей удовлетворительные результаты (разд. 16.4.4). Затем на основе полученных данных рассчитывают необходимое общее количество активности (число распадов в 1 мин).

В расчетах следует учитывать многие из перечисленных ниже факторов: период полураспада изотопа, длительность эксперимента, исходный объем образца, коэффициент разбавления, эффективность счета, молярную удельную активность, объем анализируемого образца, период биологического полураспада соединения, потери вещества при выделении, чистоту и устойчивость, а также метаболические превращения меченого соединения.

Представим, что необходимо выделить на колонке меченный тритием метаболит, полученный при инкубировании глюкозы в 3Н20. Материал, элюирующийся из колонки, распределяется в пяти фракциях по 10 мл и содержит один атом 3Н на одну молекулу метаболита. Выход метаболита в расчете на глюкозу, добавленную после разделения, составляет 5% при учете всех факторов, влияющих на образование метаболических пулов, а также побочных реакций и потерь при выделении. Для выделения метаболита используют половину всей инкубационной смеси.

В этом эксперименте выделенный материал содержит изотоп 3Н, включенный в него из молекул Н20. В процессе включения протоны весьма успешно конкурируют с 3Н+ благодаря их значительному численному превосходству, а также изотопному эффекту, обусловленному различиями в массах и химических характеристиках протонов и ионов 3Н+. Допустим, что этот эффект для протона в 4 раза больше, чем для 3Н+.

Чтобы получить хорошие результаты при подсчете импульсов, раствор, в котором проводится измерение радиоактивности, должен содержать не более 0,5 мл растворенного в воде образца. В нашем примере раствор будет содержать 0,2 мл образца. Эффективность счета для 3Н равна 43%, при этом тушение составляет 20%. Иногда эффективностью счета называют сумму этих двух величин. Для 14С и 3Н не требуется вносить поправки на распад радиоактивности.

Учитывая, что при измерении радиоактивности может быть допущена ошибка в счете (см. ниже), подсчитаем 5000 распадов. Поскольку сцинтилляционный счетчик может работать непрерывно не более 1—2 ч, для получения такого счета необходимо затратить по 10 мин на образец. Таким образом, образец объемом 0,2 мл должен содержать радиоактивность, соответствующую 500 имп/мин для фракции с самой низкой активностью. Можно подсчитать, что доля общей радиоактивности, распределенной по пяти фракциям, составляет в каждой из них 5, 20, 50, 20 и 5%. Следовательно, скорость счета для каждого образца объемом 0,2 мл должна быть равна 500, 2000, 5000, 2000 и 500 имп/мин или 8000 имп/мин для всех пяти образцов, взятых из элюата объемом 50 мл. Продолжим наши расчеты: 8000 имп/ /мин-50 (общий объем образца) «2 (общий объем реакционной смеси)-^0,43 (эффективность счета) 4-0,8 (тушение) * 4 (изотопный эффект) 4-0,05 (выход) = 1,86-108 расп./мин 3Н20, которую необходимо добавить к реакционной смеси. Имеющаяся в продаже 3Н20 содержит 25 мКи/мл или 25 мКи-2,22-109 (расп./мин/мКи) =5,55х

Ч/1Л1П . , 1,86 10е

Х1010 расп./мин/мл основного раствора: 5 55 1Q10- =

= 0,00335 мл (3,35 мкл). Лучше взять 3,35 мл основного раствора 3Н20 и развести его в 1000 раз.

Таким образом, подсчет общей радиоактивности дает информацию о необходимых количествах используемых веществ. Однако следует рассчитать также и удельную активность, т. е. число распадов в 1 мин на 1 моль или 1 мкмоль вещества, для того чтобы определить число участвующих в изотопном обмене атомов трития или выяснить, вовлечены ли в уравновешивание с атомами водорода какие-то другие процессы. В приведенном выше примере было установлено, что в 1 мл или в 55,56 ммолях воды либо в 111 мэкв. водорода, содержащихся в 1 мл, происходит 5,55-1010 расп./мин. Удельная

5,55-Ю10 - 1ЛЯ , , тт

активность равна ^ ц.]02 » или 5-Ю8, расп./мин/мэкв. Н.

Находим коэффициент разбавления удельной активности

* 1 п о 10 мл

при инкубировании 10 мл реакционной смеси:Q 003з5 мл вц^3

= 2,985, что дает удельную активность 5-108/2,985 = = 1,67-105 расп./мин/мэкв. Н. Если выделенный метаболит имел такую удельную активность, то, значит, в него был включен 1 экв. 3Н+ при изотопном эффекте, равном 4. Если удельная радиоактивность выше или ниже этого значения, то величина изотопного эффекта должна быть другой, при этом в изотопном обмене могут участвовать атомы водорода не только из 3Н20 (более низкая удельная активность) или в молекулу метаболита включается более чем один протон из 3Н20 (более высокая удельная активность). У трития изотопный эффект имеет значительную величину, тогда как у ИС, 32Р и 35S он настолько низок, что его можно не принимать во внимание. Часто бывает необходимо проводить независимое определение изотопного эффекта, измеряя скорость реакции с Н20 (или 2Н20) и с 3Н20.

Исследование ферментов с помощью изотопов

Разработаны многочисленные методики определения ферментов с использованием радиоизотопов. В ряде случаев никаких других удобных способов просто не существует. Кроме того, методам с применением изотопов присуща высокая чувствительность, что необходимо для проведения многих видов исследований. Как отмечается в другом разделе данного руководства (разд. 18.2.2), количество фермента пропорционально скорости превращения субстрата или образования продукта. Следовательно, необходимо иметь данные об изменении концентрации субстрата или продукта в зависимости от времени. Для того чтобы анализ был достоверным, начальная скорость реакции должна быть постоянной в течение небольшого промежутка времени и пропорциональной содержанию фермента в исследуемой пробе. Некоторые приборы, такие, как спектрофотометры и рН-метры, позволяют непрерывно следить за скоростью реакции в одной анализируемой пробе, причем ход реакции часто регистрируется самописцем на бумажной ленте. Однако в других случаях, как, например, при исследовании ферментов с помощью радиоизотопов, скорость реакции можно определять лишь путем периодического измерения радиоактивности в отдельных аликвотах реакционной смеси.

Одна из основных трудностей, возникающих при проведении таких анализов, связана с необходимостью отделения радиоактивного субстрата от радиоактивных продуктов. Обычно меченый субстрат присутствует в количествах, необходимых для насыщения фермента, и, следовательно, реакция по своим кинетическим параметрам является реакцией псевдонулевого порядка, т. е. ее скорость остается постоянной в течение длительного промежутка времени. При использовании чувствительных и надежных методов анализа количество образующегося продукта может составлять лишь 1% количества присутствующего субстрата. Поэтому необходимо отделить небольшое количество радиоактивного продукта от очень большого количества радиоактивного субстрата. Успешное достижение этой цели зависит от того, будет ли найден эффективный метод разделения, который позволит получить препараты этих двух веществ, содержащие 0,1% или менее примеси другого вещества. Применяемые методы разделения часто специально предназначены для какого-либо конкретного случая, поэтому их описание не входит в нашу задачу. Мы дадим лишь краткий обзор общих методов разделения. В работе Олдхэма [54] они рассматриваются более подробно.

Существуют следующие методы разделения: 1) осаждение макромолекул, таких, как полинуклеотиды, полипептиды и полисахариды; 2) выделение или поглощение летучих меченых соединений, например 3Н20, 14С02 или летучих жирных кислот, которые можно отделить от других веществ перегонкой или иным способом; 3) экстракция растворителем; 4) ионный обмен; 5) хроматография на бумаге или в тонком слое и электрофорез; 6) адсорбция и элюция; 7) выделение производных; 8) превращение немеченого продукта в меченое производное; 9) диализ и гель-фильтрация; 10) обратное изотопное разбавление.

Степень загрязнения продукта субстратом в процессе их выделения ограничивает чувствительность применяемого метода. Допустим, например, что примесь субстрата в продукте после их разделен

страница 42
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.11.2019)