Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

ия составляет 0,1%. Допустим также, что скорость счета в нулевое время (т. е. когда продукт еще не образовался) равна 100 имп/мин, что объясняется наличием перекрестного загрязнения. Желательно, чтобы скорость счета, обусловленная образовавшимся продуктом, по крайней мере равнялась скорости счета в нулевое время, т. е. составляла бы 100 имп/мин при 0,5%-ном превращении субстрата. В этом случае соотношение сигнала и фонового шума равно 1 : 1, что означает минимальную чувствительность при не слишком высоких скоростях счета (разд. 16.4.4). Чтобы получить указанную скорость счета, минимальная скорость счета для субстрата при анализе всего образца должна составлять 100 000 имп/мин. Более высокая радиоактивность не приведет к повышению чувствительности, так как соответственно возрастет и скорость счета в нулевое время. Конечно, повышение радиоактивности продукта до уровня, превосходящего скорость счета в нулевое время, уменьшит ошибку определения. Однако образование слишком больших количеств продукта нарушает необходимые для получения достоверных результатов условия, обеспечивающие псевдонулевой порядок реакции.

Из приведенного примера видно, что, хотя для насыщения фермента нужно добавлять достаточное количество субстрата, его радиоактивность не обязательно должна быть высокой. С другой стороны, если удалось полностью разделить между собой субстрат и продукт, чувствительность метода становится пропорциональной удельной активности субстрата и ограничивается только стоимостью, целесообразностью применения и доступностью этого субстрата. В этих условиях исследователи могут предпочесть субстраты, меченные 3Н, а не 14С, так как за ту же цену они могут купить препарат, удельная активность которого в 100 раз выше (см. ниже о трудностях, связанных с применением 3Н).

Разбавление радиоактивного субстрата нерадиоактивным способствует насыщению фермента субстратом и создает ряд дополнительных преимуществ. В частности, оно дает возможность снизить 1) затраты на радиоактивный материал, так как позволяет использовать меньшее количество изотопа; 2) влияние примесей и продуктов радиационного распада в радиоактивных субстратах; 3) действие нежелательного стереоизомера в радиоактивном субстрате, состоящем из смеси изомеров, в результате добавления немеченого субстрата с нуж

in Фттрсхиг методы

ной стереоконфигурацией; 4) радиационный распад субстрата. Такое разбавление повышает также точность определений.

Поскольку ферментативная активность выражается в международных единицах (ME) и 1 ME равна такому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата за 1 мин в стандартных условиях, скорость счета следует выражать в мкмоль/мин, используя удельную активность субстрата (который будет превращен в продукт предположительно с такой же удельной активностью). При определении удельной активности субстрата путем измерения радиоактивности и концентрации часто допускаются ошибки. Хотя удельная активность применяемого радиоизотопа обычно известна с точностью до ±5%» этот препарат редко используется как таковой, чаще он разбавляется большими количествами нерадиоактивной формы, что приводит к соответствующим погрешностям в измерениях радиоактивности и в определении чистоты препарата. Поэтому рекомендуется точно определять удельную радиоактивность субстрата, используемого в экспериментах. Кроме того, может возникнуть необходимость проверки радиохимической чистоты субстрата или его предварительной очистки с целью удаления продуктов распада и других примесей.

Особые трудности, встречающиеся при работе с субстратами, меченными тритием

Тритий проявляет изотопный эффект по отношению к водороду, так как обладает намного большей массой, чем водород. Этот эффект наиболее сильно выражен тогда, когда образование или разрушение связи между тритием или водородом и каким-то другим атомом является этапом, лимитирующим скорость реакции. Изотопный эффект может возрасти до такой степени, что реакция с меченными тритием соединениями практически не будет идти, как это наблюдается при карбок-силировании L-рибулозо-б-фосфата с участием 3Н-ЫАОН-фосфата и С02. Изотопный эффект может проявляться в виде изменений Vmax или /См фермента при использовании меченного тритием субстрата. Если

/См снижается, эффект не будет наблюдаться при условии насыщения фермента субстратом. При повышении Км скорость реакции будет снижаться, если концентра-ция субстрата оказывается недостаточной для насыще-ния фермента.

Следует помнить, что, когда тритий используется в качестве метки только для того, чтобы проследить превращение субстрата в продукт, 3Н (в отличие от 14С) часто выделяется в среду в виде ионов 3Н+ в результате побочных спонтанных реакций, снижая тем самым удельную активность субстрата и продуктов и, следовательно, приводя к получению ошибочных данных о низкой ферментативной активности. В некоторых случаях побочные реакции катализируются ферментами и не всегда доходят до конца. Кроме того, для меченных тритием соединений характерна «утечка» 3Н+ в результате какой-нибудь химической реакции. Все зависит от положения 3Н в молекуле. Например, а-3Н-аминокислоты теряют 3Н в ходе многих реакций, катализируемых ферментами, тогда как атомы 3Н, расположенные в других, особенно в отдаленных от функциональных групп, позициях, относительно устойчивы. Потеря трития может происходить также при выделении продукта.

Некоторые определения ферментов основаны на освобождении 3Н из специфического положения в субстрате. Результаты анализа могут быть ошибочными, если 3Н находится не только в предполагаемом месте и (или) принимает неправильное стереоположение, так как многократно показано, что ферменты активируют тритий избирательно или специфически лишь в одном из двух или более положений, занимаемых 3Н или Н.

Низкая энергия 3Н-радиации приводит к низкой эффективности счета и потерям вследствие тушения и поглощения излучения твердыми материалами. Эти два последних фактора в свою очередь обусловливают еще большую неточность измерений или даже получение ошибочных данных о более низких, чем на самом деле, скоростях ферментативных реакций. Поэтому часто необходима высокая эффективность счета и внесение поправок на тушение, рассчитанных на основе многократных измерений.

16.4.3. Жидкостные сцинтилляционные счетчики

Хотя сцинтилляционные счетчики стоят довольно дорого, в настоящее время они широко используются наряду со счетчиком Гейгера или газовыми счетчиками для измерения радиоактивности 3Н, 14С, 35S и 32Р. Это объясняется тем, что при счете в них устраняется самопоглощение образца и обеспечивается высокая эффективность счета. К тому же в случае счета с помощью сцинтилляции образцы приготовить довольно просто.

В сцинтилляционном счетчике регистрируется импульс света, возбуждаемый в флуоресцирующем веществе в результате акта радиоактивного распада. Этот импульс обнаруживается с помощью пары фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) и регистрируется. Два ФЭУ работают по схеме совпадений, благодаря чему в них происходит почти полное подавление «шумов». ФЭУ преобразует световые импульсы в импульсы напряжения, причем амплитуды последних строго пропорциональны интенсивности первых, а следовательно, и исходным энергиям возбуждающих сцинтилляцию частиц. Регулируя с помощью дискриминатора пороги амплитуд импульсов, можно просчитывать только те импульсы, которые попадают в «окно», — интервал, ограниченный задаваемой минимальной и максимальной энергией излучения. Таким образом, прибор можно настроить на 1) отсеивание многих фоновых импульсов с низкой энергией, 2) избирательный счет импульсов одного изотопа (одного класса амплитуд) или на 3) счет всех изотопов (всех амплитуд импульсов). В современных приборах такую настройку осуществляют одновременно в нескольких параллельных каналах анализатора.

Радиоактивное излучение преобразуется в сцинтилляцию с помощью молекул растворителя, которые возбуждаются под действием этого излучения, а затем передают энергию возбуждения флуоресцирующему соединению (флуорохрому, или собственно сцинтиллятору). Возбужденный флуорохром либо излучает импульс света с определенной длиной волны, либо передает энергию возбуждения вторичному флуорохрому, который в свою очередь излучает импульс света в более приемлемой для регистрации области спектра. 2,5-дифенилоксазол (РРО) и 1,4-бис-2-(5-фенилоксазолил) бензол (РОРОР) и его диметильное производное — наиболее распространенные первичные и вторичные флуорохромы, называемые собственно сцинтилляторами. Они представляют собой неполярные вещества, которые для получения сцинтилля-ционного раствора обычно растворяют в неполярных растворителях, например в толуоле. Главный недостаток сцинтилляционного счета заключается в трудности введения в неполярный раствор водных образцов, содержащих полярные растворенные вещества. Кроме того, вода и полярные растворители снижают эффективность счета, т. е. они наряду с окрашенными соединениями тушат сцинтилляцию. В связи с этими трудностями разработаны различные сцинтилляционные смеси для полярных и неполярных веществ в растворе, для твердых веществ и т. п. (см. ниже). Кроме того, в счетчике может регистрироваться высокий фон из-за флуоресценции или фосфоресценции, индуцированной солнечным светом, для исчезновения которого иногда требуется несколько часов или дней. Источником ошибок и высокого фона может быть также хемолюминесценция. Уровень фона может повышаться из-за 40К, содержащегося в стекле, из которого сделаны флаконы для счета. Вместе с тем некоторые вещества, например ТХУ, НСЮ4, вода, пиридин и окрашенные соединения, тушат сцинтилляцию.

Твердые вещества

В сцинтилляторе можно просчитывать небольшие кусочки бумаги или кусочки сорбента с тонкослойных пластинок. Основные трудности, которые при этом возникают, связаны с самопоглощением частиц, разной ориентацией образцов, неодинаковой солюбилизацией радиоактивного материала, а также с использованием внешнего стандарта для определения эффективности счета (см. ниже). Поскольку прямого способа определения самопоглощения не

страница 43
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2019)