Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

4—857 (1965).

62. Turner J. C. Sample preparation for liquid scintillation counting, The Radiochemical Centre, Amersham, England, 1967.

Гель-электрофорез

Общая литература

63. Castimpoolas N. Isoelectric focusing: fundamental aspects, Sep, Sci, 10(1), 55—75 (1975).

64. Davis B. J. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins, Ann. N. Y. Acad. Sci, 12, 404—427 (1964).

65. Kpchwa 5, Electrophoretic and immunoelectrophoretic characterization of immunoglobulins, p. 121 — 134. In: N. R. Rose and H. Friedman (ed.), Manual of clinical immunology, 2nd ed. American Society for Microbiology, Washington, D. C, 1980.

66. Mauer H. R. Disc electrophoresis and related techniques of poly-acrylamide gel electrophoresis. W. de Gruyter, New York, 1971.

67. Ornstein L. Disc electrophoresis. I. Back-ground and theory. Ann. N. Y. Acad. Sci, 121, 321—403 (1964).

Специальная литература

68. Blakesly R. W., Boezi J. A. Anal. Biochem, 82, 580—582 (1977).

69. Castimpoolas N. Anal. Biochem, 26, 480—482 (1968).

70. Crestfield Л. M., Moore 5, Stein IF. H. J. Biol. Chem, 238, 622— 627 (1963).

71. Dunker A. Rueckert R R. J. Biol Chem, 244, 5074—5080 (1969).

72. Elson ?, Sovin Г. M. Anal. Biochem, 27, 193—204 (1969).

73. Grasslin D.f Weicker Я, Barwich D. Z. Z. Khn. Chem. Klin. Biochem., 8, 288—291 (1970).

74. Hedrick J. L., Smith A. I. Arch. Biochem. Biophys, 126, 155—164 (1968).

75. Loening U. ?. Biochem. J, 113, 131—138 (1969).

76. McPhie P., Hounsell J., Gratzer W. B. Biochemistry, 5, 988—993 (1966).

77. O'Farrell P. J. Biol. Chem, 250, 4007—4021 (1975).

78. Peacock A C, Dingman С W. Biochemistry, 7, 668—674 (1968).

79. Riley R. p., Coleman M. K. J. Lab. Clin. Med, 72, 714—720 (1978).

80. Weber K., Osborn M. J. Biol Chem, 244, 4406—4412 (1969).

81. Wright G, L Canalco Newsletter, no 10, p. 6. Canalco inc., Rockville, Md. (1968).

Манометрия

Общая литература

82. Umbreit W. W.t Burris R H, Stauffer J. F. Manometric techniques,

Burgess Publishing Co, Minneapolis, 1957.

Глава 17

ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ

Р. Хансон, Дж. Филлипс

Методы, описанные в этой главе, широко используются в научно-исследовательской практике; вместе с тем их можно применять и в лабораторных занятиях студентов старших и выпускных курсов. В конце главы приводится список работ, в которых описаны другие методы, а также — более подробно — методики, рассмотренные в данной главе. Мы не обсуждаем здесь методы, требующие дорогостоящего оборудования или специального обучения персонала. Потребность в специальных методиках с вариациями в зависимости от природы анализируемых образцов, оборудования и квалификации сотрудников мы старались удовлетворить преимущественно за счет ссылок на другие источники информации, а не путем описания экспериментальных деталей.

17.1. ОСНОВНЫЕ ХИМИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ: ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ

Включение меченых соединений в бактериальные клетки применяется для определения скорости синтеза и количества синтезированных веществ, а также фракционирования низко- и высокомолекулярных соединений, содержащихся в клетках [2]. После инкубации клеток с меченым субстратом и фракционирования метабо^ литов в каждой фракции можно определить радиоактивность.

Макромолекулы осаждают с помощью охлажденного разбавленного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и отделяют от низкомолекулярных веществ центрифугированием. Надосадочная фракция низкомолекулярных веществ содержит пулы таких метаболитов, как углеводы и их производные, органические кислоты, аминокислоты, нуклеотиды и коферменты, а также олигоБАКТЕРИАЛЬНЫЕ КЛЕТК 1

Холодная ТХУ

. 1

п

НИЗКОМО'\Е<УЛ*>-Ь.Е ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ:

ВЕиЛс ел

ЙЕШ.ЕСТВА Растборыт&ли

ЛИПИДЫ

РНК+ДНК + БЕЛКИ NaOH

1

ДНК+БЕЛКИ Горячая ТХУ

Рис. 17.1. Схема фракционирования бактериальных клеток на основные химические компоненты.

ДНК

6ЕЛКИ

нуклеотиды и основные белки с числом нуклеотидных или аминокислотных остатков соответственно менее двадцати [2]. Осадок, содержащий макромолекулы, последовательно экстрагируют: липиды — органическими растворителями, РНК — щелочами, ДНК — горячей ТХУ. Осадок, остающийся после такого экстрагирования, содержит клеточные белки. На рис. 17.1 изображена схема процесса фракционирования.

Полное разделение всех химических компонентов и выделение макромолекул определенного типа в одной фракции невозможно осуществить с помощью какого-либо одного метода. Как правило, для этого приходится применять несколько методик. Ниже приведены методики фракционирования, описанные Кеннелом i[l], которые представляют собой модификации методов Ро-бертса и др. [2].

17.1.1. Реактивы и материалы

Физиологический раствор: 0,85%-ный (вес/объем) раствор NaCI в дистиллированной воде.

Растворы 50, 20, 10 и 5%-ной (вес/объем) ТХУ в дистиллированной воде. (Предостережение! ТХУ проникает через кожу, растворяется в липидах и вызывает раздражение кожи. В связи с этим с ней следует работать в резиновых перчатках, соответствующей лабораторной одежде и защитных очках )

Этанол: 70%-ный раствор (объем/объем) в дистиллированной ©оде. (Предостережение! Этанол легко воспламеняется. Следует избегать работы вблизи открытого огня и электрических приборов, вызывающих искрообразование)

Диэтиловый эфир. (Предостережение! Эфир легко воспламеняется при контакте его паров с огнем или электрическими искрами. В лаборатории следует хранить минимальное количество эфира. Все растворы эфира нужно нагревать в герметичных контейнерах на водяной бане, а не в термостате. Чтобы избежать вдыхания паров эфира, следует работать под тягой.)

Гидроксид натрия (0,5 н.); растворяют 2,0 г в 100 мл дистиллированной воды.

Бычий сывороточный альбумин: растворяют 0,1 г в 10 мл дистиллированной воды и хранят в холодильнике.

Стеклянная посуда. 20-мл пирексовые стеклянные химические стаканы, 10-мл колбы Эрленмейера, 25-мл мерные колбы, 15- и ?30-мл центрифужные пробирки с крышками.

Фильтры с синтетическими мембранами или мембранами из стекловолокна с размером пор 0,45 мкм и диаметром 25 мм. Фильтры должны быть устойчивы к кислотам и растворителям. Пирекоовый держатель для фильтрования должен быть снабжен пористой стеклянной прокладкой.

Колба для фильтрования под вакуумом на 125 мл и пробирки, обрезанные таким образом, чтобы при помещении в колбу они доходили до держателя фильтра. Пробирки служат для сбора фильтратов.

Инфракрасная лампа для нагревания мощностью 250 Вт и рефлектор для высушивания проб. Баня с ледяной водой.

Водяные бани: температура регулируется до 80 °С. Центрифуга с охлаждением: скорость до 10 000 g, ротор рассчитан на 30-мл центрифужные пробирки.

17.1.2. Мечение клеток

(Предостережение! Применение радиоактивных изотопов строго контролируется. Персонал, работающий с изотопами, должен быть знаком с соответствующими правилами (разд. 16.4.1). Необходимо соблюдение всех предосторожностей.)

Количество используемой культуры зависит от типа микроорганизма и условий его роста. Например, для получения 10 мг клеток Е. coll достаточно 30 мл культуры, собранной в середине фазы экспоненциального роста.

Для определения состава клеток требуется равномерно меченный субстрат, например 14С-глкжоза (5 мкКи/30 мл культуры, содержащей 1% глюкозы в качестве единственного источника углерода). Включение аминокислоты в белок можно измерить, добавив-меченую аминокислоту (2—5 мкКи) к 30 мл культуры* растущей на солевой среде с глюкозой. Для измерения включения определенной аминокислоты в белок идеально подходит ауксотрофный мутант, неспособный ее синтезировать. В этом случае к среде добавляют 10 мкг/мл немеченой аминокислоты и 2—5 мкКи меченой аминокислоты. Важно, чтобы в качестве предшественника меченого белка использовалась неметаболизируемая аминокислота. Лейцин, лизин, фенилаланин и тирозин мета-болизируются большинством бактерий в очень незначительной степени. При работе с меченым тимидином в качестве предшественника ДНК и меченым урацилом или уридином в качестве предшественников РНК также рекомендуется использовать ауксотрофы, чтобы получить хорошее включение метки во фракциях.

Для изучения состава клеток обычно используют культуры в фазе экспоненциального роста. Во время лаг-фазы и стационарной фазы состав клеток отличается от состава в экспоненциальной фазе роста.

17J.3. Низкомолекулярные вещества

1. Культуру быстро охлаждают, помещая ее в лед. Радиоактивно меченные клетки (около 10 мг сухого веса биомассы) отделяют от ростовой среды центрифугированием (5000 g, 10 мин, 5°С). Осажденные клетки дважды промывают физраствором (1/б объема культуры), центрифугируя их при 5°С.

2. Клетки суспендируют в 10 мл дистиллированной воды в центрифужной пробирке. Суспензию помещают в ледяную баню и добавляют к ней 10 мл холодной ТХУ. Центрифужную пробирку закрывают крышкой и переворачивают для перемешивания содержимого. Пробирку помещают на 5 мин в ледяную баню для полного выпадения осадка.

3. Пробирку центрифугируют при 5000—10 000 g в течение 15 мин при температуре 0—4°С и надосадочную фракцию осторожно декантируют в 25-мл мерную колбу, не взбалтывая осадка.

4. К осадку добавляют 4 мл 10%-ной холодной ТХУ, суспендируют его и вновь центрифугируют. Надосадоч-ную фракцию объединяют с надосадочной жидкостью, полученной после первого центрифугирования, и разбавляют дистиллированной водой до 25 мл.

5. Определяют радиоактивность объединенной фракции, содержащей низкомолекулярные вещества (пул метаболитов) непосредственно в растворе, применяемом для определения радиоактивности в водных образцах, как описано в предыдущей главе (разд. 16.4.2). Чтобы внести поправку на тушение флуоресценции за счет ТХУ, используют внутренние или внешние стандарты. В другом варианте ТХУ удаляют путем трехкратного экстрагирования равными объемами эфира. Однако в процессе экстрагирования эфиром из низкомолекулярной фракции удаляются органические кислоты. Радиоактивность в образцах проэкстрагированной фракции измеряют в сцинтилляционной смеси, пр

страница 50
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.11.2019)