Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

в описанной здесь процедуре.

17.2. УГЛЕВОДЫ

Бактерии содержат много различных углеводов: свободные сахара, производные Сахаров, простые полисахариды (полимеры, состоящие из одного сахара или производного сахара, такие, как гликоген), сложные полисахариды (полимеры, состоящие из нескольких Сахаров, аминосахаров, уроновых кислот и т. д.) и макромолекулы, включающие углеводные и неуглеводные компоненты (липополисахариды, пептидогликаны, тейхое-вые, липотейхоевые, тейхоуроновые, нуклеиновые кислоты, гликопротеины и т. д.).

Колориметрические методы, основанные на пробе Молиша на углеводы i[4, 7, 8], пригодны для количественного определения простых Сахаров и их полимеров. Специальные методики определения пентоз в нуклеиновых кислотах (рибозы и дезоксирибозы) описаны ниже в разделе, посвященном нуклеиновым кислотам (разд. 17.5.1 и 17.5.2). Более полные описания аналитических методов определения углеводов сделаны Гербертом и сотр. [5] и Коловиком и Капланом [4].

17.2.1. Определение общего количества углеводов антроновым методом

Наиболее удобные способы определения общего количества углеводов включают нагревание среды, клеток или выделенных углеводов с серной кислотой с целью гидролиза полисахаридов, а также дегидратации моносахаридов. При этом из пентозы образуются фурфуро-лы, а из гексозы — гидроксиметилфурфуролы. Затем растворы фурфуролов и гидроксиметилфурфуролов обрабатывают реактивом (ароматическим амином или фенолом) для получения окрашенного соединения, которое анализируют колориметрически или спектрофотометри-чески. Описано много вариантов этой методики, называемой пробой Молиша [4, 7, 8]. В этих реакциях пен-тоза, гексоза и гептоза, а также их производные (за исключением аминосахаров) дают окрашенные вещества, тогда как триоза и тетроза не образуют хромофоров.

Ни одна из этих методик не позволяет точно определить все углеводы, содержащиеся в бактериях, так как для разных Сахаров интенсивность окраски при данной длине волны различна ([5]. Описанные ниже методики с использованием антрона и фенола отличаются простотой. При их выполнении почти не мешают другие клеточные компоненты, а наиболее распространенные в микробных клетках гексозы дают сходную реакцию, что обеспечивает надежное определение общего содержания углеводов.

Обе методики позволяют определять общее количество углеводов в бактериальных клетках, содержащих ^10% полимеров гексозы. При низком содержании гек-соз в клетках пентозы в нуклеиновых кислотах мешают определению.

Реактивы и оборудование

Физиологический раствор: 0,85%-ный (вес/объем) раствор NaCl в дистиллированной воде.

Основной раствор глюкозы: 100 мг глюкозы растворяют в 100 мл 0,15%-ной (вес/объем) бензойной кислоты, используемой в качестве консерванта. Хранят при 5°С. Раствор годен в течение нескольких месяцев. Перед использованием раствор разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1 : 10 для получения концентрации глюкозы 100 мкг/мл. Из разбавленного раствора готовят стандартные (10—100 мкг/мл) растворы глюкозы.

Раствор серной кислоты (75%-ный, объем/объем): 750 мл концентрированной чистой серной кислоты (ч. д. a.; reagent-grade) добавляют к 250 мл дистиллированной воды. (Внимание! Кислоту медленно вливают в воду, находящуюся в сосуде из пирекса. Нельзя вливать воду в кислоту. Другие предосторожности описаны* в разд. 17.2.2).

Антроновый реактив: 200 мг антрона добавляют к 5 мл абсолютного этанола и разбавляют до 100 мл 75%-ной H2SO4. (Предостережение I См. разд. 17.2.2.) Перемешивают до растворения. Ежедневно готовят свежий раствор и хранят его в холодильнике.

Толстостенные пирексовые термостойкие пробирки размером* 15X2,5 см.

Спектрофотометр или колориметр.

Стеклянные кюветы.

Методика

Бактериальные клетки отмывают от компонентов среды центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин. Осадок суспендируют в физиологическом растворе и вновь центрифугируют. Осажденные клетки ресуспендируют в дистиллированной воде, отбирают пипеткой пробы клеточной суспензии (0,1—1,0 мл) и вносят их в термостойкие пробирки. Объем во всех пробах доводят дистиллированной водой до 1 мл. Готовят контрольную пробу дистиллированной воды (1,0 мл) и стандарты, содержащие от 10 до 100 мкг глюкозы в 1,0 мл. Пробирки и антроновый реактив рхлаждают в бане со льдом. Добавляют 5 мл охлажденного антронового реактива, быстро перемешивают, встряхивая пробирки в ледяной воде, и затем продолжают перемешивание в ледяной бане в течение 5 мин. Пробирки переносят в кипящую баню ровно на 10 мин, после чего помещают их в ледяную воду. Измеряют интенсивность окраски в каждой пробирке с помощью спектрофотометра или колориметра при длине волны 625 нм (разд. 16.1.1). Концентрацию глюкозы в пробах определяют по калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью стандартных растворов и концентрацией глюкозы.

17.2.2. Определение общего содержания )У г лево дов

в реакции с фенолом

Реактивы и оборудование

Фенольный реактив: 5 г чистого (ч. д. a.; reagent-grade) фенола растворяют в 100 мл дистиллированной воды. (Осторожно! Фенол вызывает тяжелые ожоги кожи и глаз. При работе с ним нужно надевать защитные очки, перчатки и одежду. Нельзя насасывать его в пипетку ртом.)

Концентрированная чистая (ч. д. a.; reagent-grade) серная кислота. (Меры предосторожности при работе с ней см. ниже.)

Стандартные растворы глюкозы (см. выше описание методики с антроном).

Толстостенные пирексовые термостойкие пробирки размером 15X2,5 см.

Спектрофотометр или колориметр. Стеклянные кюветы.

Методика

Анализируемые пробы вносят пипеткой в толстостенные пирексовые пробирки. Объем в каждой пробе доводят дистиллированной водой до 1,0 мл. Готовят контрольную пробу с 1,0 мл дистиллированной воды и серию стандартных растворов глюкозы с концентрациями от 10 до 100 мкг/мл. Во все пробы добавляют 1 мл феноль-ного реактива, быстро и тщательно перемешивают. Затем добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты, так же быстро перемешивают и оставляют на 10 мин. (Осторожно! При добавлении серной кислоты происходит нагревание, а иногда и разбрызгивание смеси, что может вызвать тяжелые ожоги при попадании на кожу или в глаза. Необходимо пользоваться защитными очками и перчатками. Нельзя насасывать раствор в пипетку ртом. Необходимо знать меры по оказанию первой помощи при попадании кислот на кожу и в глаза.) Пробирки помещают на 15 мин в водяную баню с температурой 25 °С и затем снимают показания оптической плотности в каждой пробе при 488 нм против контрольного образца, приготовленного без глюкозы (разд. 16.1.1). Концентрацию глюкозы в пробах определяют по стандартной калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью стандартных растворов и концентрацией глюкозы.

17.2.3. D-Глюкоза

В результате гидролиза простых и сложных полисахаридов в бактериальных клетках образуется большое число моносахаридов. Поскольку полимеры состоят из различных мономеров, за исключением гомополимеров, таких, как гликоген, количественное определение отдельных Сахаров представляет собой сложную аналитическую проблему, которую порой можно решить лишь с помощью газожидкостной хроматографии [16]. Однако некоторые сахара и производные Сахаров определяют с помощью специфических колориметрических реакций или ферментативных методов [4]. Ниже приведем определения содержания двух наиболее широко распространенных Сахаров

Фермент глюкозооксидаза катализирует следующую реакцию:

p-D-Глкжоза -f- 02 —* Глкжоновая кислота -f- Н202

Перекись водорода в присутствии пероксидазы и восстановленного хромофора приводит к образованию окисленного хромофора, окрашенного в коричневый или синий цвет, количество которого можно измерить спектро-фотометрически. В качестве хромофоров используются различные вещества. Смесь ферментов, необходимых для анализа, можно приобрести в комплекте у различных фирм.

Глюкозооксидазный тест специфичен, чувствителен и прост в осуществлении. Окрашенные вещества в этой реакции появляются только за счет глюкозы и 2-дезок-сиглюкозы.

Реактивы

Основной раствор глюкозы: 300 мг D-глюкозы растворяют в 100 мл 0,15%-ной (вес/объем) бензойной кислоты. Хранят в холодильнике. Перед применением разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1 : 10 и доводят рН до 7,0.

Коммерческий препарат глюкозооксидазы—пероксидазы. Готовят смесь ферментов, как указано в инструкции к препарату.

Хромофор. Входит в комплект имеющихся в продаже реактивов. Готовят согласно инструкции.

Методика

Пробы разбавляют дистиллированной водой так, чтобы они содержали 0,05—0,3 мг глюкозы в 1 мл. Устанавливают рН от 6,8 до 7,2 добавлением 0,1 н. КОН или 0,1 н. НС1. Для определения рН можно пользоваться индикаторной бумагой. Готовят контрольную пробу и серию стандартов, содержащих 0,05—0,3 мг глюкозы в 1 мл, путем разбавления дистиллированной водой. Добавляют фермент и хромофор и инкубируют смесь согласно инструкции фирмы-изготовителя. Добавляют пастеровской пипеткой 1 каплю 4 н. НС1 и определяют оптическую плотность в стеклянной кювете при 400 нм (разд. 16.1.1). Определяют концентрацию глюкозы в пробах по стандартной калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью стандартных растворов и концентрацией глюкозы.

17.2.4. Галактоза

Комплект реактивов для определения галактозы с помощью галактозооксидазы также можно приобрести у различных фирм. В комплект входят галактозоокси-даза, хромофор и стандарты. Поскольку галактозоокси-даза окисляет С6-гидроксиметильную группу галактозы с образованием галактуроновой кислоты, она может окислять и некоторые галактозиды.

Применение оксидазного теста на глюкозу и галактозу

Оксидазный тест на глюкозу и галактозу позволяет определять содержание этих веществ в ростовых средах, в нейтрализованных гидролизатах полисахаридов и в ферментных реакционных смесях, например содержание глюкозы при ферментативном гидролизе целлюлозы, ит. п. Глюкозооксидаза окисляет только p-D-глюкозу, но в присутствии мутаротазы (входящей в некоторые имеющиеся в продаже препараты) она позволяе

страница 52
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.09.2019)