Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

идентификация свободных оснований. В ампулу для лиофилизации, где уже находится фракция очищенных фосфолипидов, полученная в результате разделения с помощью тонкослойной хроматографии (разд. 17.3.4), вносят 2 мл 1 н. НС1. Ампулу запаивают и нагревают при 100°С в течение 4 ч. Затем ее охлаждают и открывают. Содержимое ампулы переносят в 10-мл пробирку с завинчивающейся пробкой и добавляют к нему 2 мл дважды перегнанного гексана. Перемешивают с помощью встряхивателя Vortex и оставляют на некоторое время для разделения фаз. Удаляют водный слой и лиофилизуют или высушивают его в испарителе.

Остаток растворяют в 0,1 мл дистиллированной воды. На хроматографическую бумагу Whatman № 1 наносят отдельно каждую пробу в виде пятна диаметром 10 мм и проводят фракционирование методом нисходящей хроматографии, используя систему растворителей фенол—этанол—уксусная кислота (50 : 5 : 6; по объему). В качестве стандартов для хроматографирования и идентификации свободных оснований используют аналогично обработанные известные фосфолипиды или холин, этаноламин, серии и 1Ч,]М-диметилэтаноламин [19].

После пропускания растворителя хроматограмму сушат в течение ночи в вытяжном шкафу и затем разрезают на полоски. Одну полоску, содержащую стандарт или неизвестное вещество, опрыскивают нингидрином, а другую (с тем же неизвестным веществом или стандартом) — реактивом Драгендорфа. Серии и этаноламин после обработки нингидрином проявляются в виде синих пятен с значениями Rf около 0,27 и 0,51 соответственно. Холин и М,г^-диметилэтаноламин не реагируют с нингидрином. Реактив Драгендорфа окрашивает холин в оранжевый цвет, а диметилэтаноламин — в бледно-оранжевый. Значения Rf для холина и ]М,]М-диметил-этаноламина составляют ~0,93 и 0,86 соответственно.

Щелочной гидролиз фосфолипидов и определение глицерофосфатов [19, 20]. К 1 —5 мг фосфолипидов, полученных хроматографией на флорисиле (разд. 17.3.3), добавляют 0,2 мл хлороформа, 0,3 мл метанола и 0,5 мл метанольного раствора гидроксида натрия. Смесь перемешивают в пробирке со стеклянной пробкой с помощью встряхивателя Vortex и оставляют при комнатной температуре на 15 мин.

Добавляют 1,9 мл смеси хлороформ — метанол — 1,25 н. NaOH (1:4:4,5; по объему), переносят в коническую центрифужную пробирку, перемешивают смесь с помощью встряхивателя Vortex и центрифугируют 1 мин при 600 g. Верхний слой метанольно-водного слоя удаляют пастеровской пипеткой. Добавляют к нему ка-тионообменную смолу, энергично встряхивая до тех пор, пока рН, измеренный с помощью индикаторной бумаги, не станет равным 5—6. Пробу центрифугируют и отделяют жидкость от смолы с помощью пастеровской пипетки. Добавляют 1—2 капли метанольного раствора гидроксида аммония для того, чтобы раствор стал слегка щелочным (рН 7,5—9,0). рН определяют с помощью индикаторной бумаги. Жидкость выпаривают досуха в токе азота при 30 °С и остаток растворяют в 0,1 мл смеси метанола и воды (10:9; по объему).

Растворенные глицерофосфаты идентифицируют совместной хроматографией с продуктами, образующимися после аналогичной обработки известных фосфолипидов [19]. Для этого три аликвоты каждой пробы по 25 мкл каждая наносят на бумагу Whatman № 1 на расстоянии 10 см друг от друга и ставят нисходящую хро-матограмму в системе фенол — этанол — уксусная кислота (50:5:6). После пропускания растворителя хро-матограмму высушивают в течение ночи в вытяжном шкафу и режут на полоски. Одну из полосок, содержащую глицерофосфат, опрыскивают реактивом Драген-дорфа, другую опрыскивают нингидрином, а третью — реактивом Форбека и Маринетти, состоящим из смеси салицилсульфоновая кислота — трихлорид железа [33] (см. ниже). Фосфатидилэтаноламин (.Rf = 0,66) и фосфа-тидилсерин (Rf = 0,28) после опрыскивания нингидрином и выдерживания в течение нескольких часов при комнатной температуре дают розовато-лиловые пятна. Фос-фатидилхолин (/?f = 0,86) и фосфатидилэтаноламин (ф = 0,80) после обработки реактивом Драгендорфа проявляются в виде оранжевых и бледно-оранжевых пятен соответственно и не дают никакой окраски с нингидрином. Все реакции с реактивом салицилсульфоно-вая кислота — трихлорид железа описаны ниже.

Определение глицерофосфатов на хроматограммах при помощи реактива салицилсульфоновая кислота — трихлорид железа [19].

Растворяют 1,5 г FeCl3-6H20 в 30 мл 0,3 н. НС1 и разбавляют 90 мл ацетона. Погружают в этот реактив полоски бумаги, вырезанные из хроматограмм, сушат в вытяжном шкафу и затем вновь погружают в раствор, приготовленный растворением 1,5 г салицилсульфоно-вой кислоты в 100 мл ацетона. Глицерофосфаты проявляются в виде белых пятен на розовато-лиловом фоне.

17.3.7. Жирные кислоты

Одним из наиболее широко распространенных методов определения жирных кислот в бактериальных клетках является газожидкостная хроматография их метиловых эфиров, полученных из фосфолипидов, суммарных липидов и других липидных фракций. Метанолиз липидов происходит при нагревании их в смеси серной кислоты и метанола. Метиловые эфиры экстрагируют гекса-ном, после чего каждую из жирных кислот количественно измеряют с помощью газохроматографического прибора, снабженного подходящей колонкой (разд. 16.3.4).

Для получения метиловых эфиров жирных кислот используют несколько методик. Одна из них, отличающаяся простотой и удобством, описана ниже. В ссылках на литературу можно найти и другие методики, известные к настоящему времени [26, 32].

Реактивы и материалы

Газовый хроматограф, снабженный пламенно-ионизационным детектором и соответствующей электронной системой для регистрации. Существует несколько вариантов выбора хроматографических колонок и программ температурных режимов. При выборе газохро-матографической методики, пригодной для данного прибора и анализируемого материала, исследователь может воспользоваться рекомендациями, содержащимися в работах [20, 26, 29, 30, 32].

w-Гексан, спектрально чистый (Merk and Co., Inc., Rahway, N. J.).

5%-ный раствор серной кислоты в метаноле: добавляют 5 мл (ч. д. a.; reagent grade) серной кислоты к 95 мл безводного метанола. Перед использованием каждый раз готовят свежий раствор. (Предостережение! См. разд. 17.2.1 и 17.3.1.)

Стандарты. Метиловые эфиры, в состав которых входят жирные кислоты С}з—Сао с прямыми и разветвленными цепями (Laro-dan Lipids, Malmo, Sweden, или Applied Science Laboratories, State College, Pa.).

Пирексовые пробирки на 15 мл со стеклянными пробками.

Методика

Вносят от 0,5 до 1 мг очищенных суммарных липидов (разд. 17.4.2) в пробирку со стеклянной пробкой и упаривают растворитель в токе азота при 30—37°С. К высушенным липидам добавляют 4 мл 5%-ного (вес/ /объем) раствора серной кислоты в метаноле и нагревают 2 ч при 70 °С. После охлаждения добавляют 4 мл я-гексана и встряхивают пробирку 10 мин. Отделяют гексановый слой. Повторно экстрагируют метанольный слой 4 мл гексана. Для газохроматографического анализа используют объединенные гексановые экстракты (разд. 16.3.4). Метиловые эфиры жирных кислот идентифицируют, сравнивая их времена удерживания с временами удерживания известных жирных кислот. Количественное определение проводят путем сравнения площадей пиков с площадью пика внутреннего стандарта, внесенного в каждую пробу [26].

17.3.8. Поли-р-гидроксибутират [27]

Поли-р-гидроксибутират хотя и является липидом, однако не экстрагируется из бактериальных клеток растворителями, обычно используемыми для экстракции липидов. По методике, описанной Лоу и Слепеки [27], поли-р-гидроксибутират экстрагируется горячим хлороформом из клеток, предварительно обработанных гипо-хлоритом для удаления мешающих веществ. В результате гидролиза образуется р-гидроксимасляная кислота, которая в концентрированной серной кислоте дегидратируется и превращается в кротоновую кислоту. Кро-тоновая кислота поглощает УФ-свет с максимумом оптической плотности при 235 нм, обусловленном двойной связью.

Реактивы и [материалы

Раствор гипохлорита натрия: имеющийся в продаже раствор хлорной извести, например клорокс, или другая хлорная известь.

Кюветы: 1-см кюветы, изготовленные из кварца или другого материала, пропускающего УФ-свет.

Спектрофотометр для измерения поглощения в ультрафиолете.

Полипропиленовые или стеклянные центрифужные пробирки размером 12x100 мм на 30 мл. Пластмассовые центрифужные пробирки нужно мыть горячим хлороформом и этанолом для удаления пластификаторов. (Предостережение! См. разд. 17.3.1.)

Центрифуга с охлаждением (скорость до 10 ООО g).

Пирексовые термостойкие пробирки.

Мерная колба иа 10 мл.

Баня с кипящей водой.

Серная кислота (ч. д. a.; reagent grade). Качество серной кислоты имеет большое значение. Низкие сорта содержат вещества, поглощающие ультрафиолет, из-за чего контрольные (слепые) пробы имеют высокую оптическую плотность. (Предостережение! См. разд. 17.2.2.)

Стандарт: 3-гидроксимасляную кислоту (0,5 мг/мл) растворяют в этаноле (1 : 10) для получения раствора с концентрацией 50 мкг/мл.

Методика

Центрифугируют в течение 15 мин при 10 000 g (4°С) такой объем культуры, в котором содержится 10—20 мг (сухого веса) бактериальных клеток. Сухой вес определяют, взвешивая высушенные клетки из равного объема культуры (разд. 25.2.2). Добавляют гипо-хлорит натрия в количестве, равном первоначальному объему культуры, переносят суспензию в центрифужную пробирку, инкубируют в течение 1 ч при 37 °С и затем центрифугируют 15 мин при 10 000 g для осаждения гранул липидов. Температура, при которой проводится центрифугирование, не имеет значения. Осадок суспендируют в воде и центрифугируют при 10 000 g в течение 15 мин. Надосадочную фракцию отбрасывают, а гранулы липидов, прилипшие к стенкам центрифужной пробирки, промывают сначала 5 мл ацетона, а потом 5 мл этанола. Это делают с целью удаления воды. В завершение липидные гранулы суспендируют в 5 мл ацетона с помощью встряхивателя Vortex и центрифугируют 15 мин при 10 000 g. Осадок суспендируют в 5 мл этанола, используя встряхиватель Vortex, и вновь центрифугируют 15 мин при 10000 g.

Промытые гранулы растворяют в 3 мл кипящего хлороформа и инкубируют в к

страница 57
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(09.12.2019)