Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

растворяют в 90 мл дистиллированной

воды. Доводят рН до 7 с помощью 5 н. HCI и разбавляют водой

до 100 мл

Дезоксирибонуклеаза: 5 мг сухого порошка фермента растворяют в 1,0 мл трис-буфера

Рибонуклеаза: 5 мг сухого порошка фермента растворяют в 1 мл трис-буфера

Центрифуга с охлаждением (максимальная скорость 22 000 g)

Толстостенные стеклянные (пирексовые) центрифужные пробирки на 50 мл

Центрифужные стаканы (100—250 мл) и соответствующие роторы. (Предостережение! Тонкостенные пирексовые стеклянные пробирки не выдерживают скорости 22 000 g.)

Ультразвуковой дезинтегратор, пресс Френча или механическая мельница

Методика

Бактериальные клетки охлаждают в ростовой среде до 4°С льдом и собирают центрифугированием в 100— 250-мл стаканах (5000 g, 15 мин). Клетки ресуспендируют в 20 мл охлажденного физиологического раствора и снова центрифугируют. Осажденные клетки используют сразу же или лиофилизуют их и хранят в морозильнике для предотвращения автолиза. Готовят однородную суспензию клеток в 20 мл холодной воды. Лиофилизован-ные клетки суспендируют в несколько этапов: сначала делают густую кашицу из клеток, медленно добавляя воду и постоянно помешивая образующуюся суспензию. Клетки перемешивают механическим способом или с помощью ручного гомогенизатора до полного диспергирования. При отсутствии механического гомогенизатора можно сделать то же самое путем всасывания и выдувания суспензии через пипетку с ватным тампоном. Суспензию хранят на холоду для предотвращения автолиза клеточных стенок в течение всех процедур.

Клетки разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора, механической мельницы или пресса Френча (разд. 5.1). Сразу же после разрушения суспензию клеток нагревают до 75 °С. Эту температуру поддерживают в течение 15 мин для инактивации автолитических ферментов. Неразрушенные клетки удаляют центрифугированием при низкой скорости (1000 g, 15 мин). Осадок отбрасывают, а надосадочную фракцию центрифугируют в 30-мл центрифужных пробирках при 22 000 g в течение 15 мин. При этом под полупрозрачным слоем клеточных стенок должен образоваться тонкий мутный слой неразрушенных клеток. Верхний слой отбирают, а осадок осторожно промывают охлажденным 0,1 М трис-бу-фером, рН 7, с помощью пастеровской пипетки. Когда объем верхнего слоя достигнет 15 мл, его вновь центрифугируют при 1000 g в течение 10 мин. Осадок отбрасывают, а надосадочную фракцию центрифугируют 15 мин при 22 000 g. Верхний слой ресуспендируют в трис-буфе-ре. Эти операции повторяют до тех пор, пока не получат гомогенную фракцию клеточных стенок, не содержащую интактных клеток.

Фракцию клеточных стенок суспендируют в 100 мл насыщенного хлороформом трис-буфера. Добавляют дезоксирибонуклеазу (0,5 мл раствора с концентрацией 1 мг/мл) и рибонуклеазу (1,0 мл раствора с концентрацией 5 мг/мл) и инкубируют суспензию при 37 °С 30 мин. Добавляют 100 мкг кристаллического трипсина и продолжают инкубацию при той же температуре еще б ч. Клеточные стенки осаждают центрифугированием и промывают, как описано выше. Осаждение и промывание повторяют до получения гомогенного слоя. Для удаления денатурированных белков добавляют трипсин. Этот фермент вызывает автолиз пептидогликана некоторых бактерий. В этом случае при центрифугировании осадка не образуется. Если это наблюдается, обработку трипсином проводить не следует. Выделение пептидогликана из большинства грамотрицательных бактерий требует большого количества клеточного материала (20—30 г) из-за низкого содержания этого полимера в бактериях и его повышенной чувствительности к автолизу. Методика получения 150 мг пептидогликана из клеток Е. coli описана Вейделем и др. [56],

Содержание гексозамина и мурамовой кислоты определяют после кислотного гидролиза очищенных клеточных стенок (разд. 17.2.7 и 17.2.8). Аминокислоты определяют с помощью аминокислотного анализатора или бумажной хроматографии [58]. Наличие нескольких аминокислот означает загрязнение белками мембран, клеточной стенки или цитоплазмы.

В работах Коттела и др. [51] и Гуйзена и др. [48] продемонстрированы хорошие примеры того, как можно получить исчерпывающие данные о составе клеточных стенок с помощью различных химических методов, которые позволяют определять восстанавливающие сахара, незамещенные аминогруппы аминокислот и т. д.

17.4.2. Липополисахариды [42]

Реактивы, материалы и оборудование

Физиологический раствор: 0,9%-ный (вес/объем) раствор NaCl в дистиллированной воде.

Раствор фенола: 10 мл дистиллированной воды добавляют к 90 мл подогретого {60 °С) дважды перегнанного фенола. (Предостережение! Фенол вызывает сильные ожоги при попадании на кожу и в глаза. При работе с этим реактивом следует надевать защитные перчатки, одежду и очки. Пары фенола также опасны. С горячим фенолом необходимо работать в вытяжном шкафу.)

Центрифуги, роторы и пробирки: центрифуга на 10 000 g и ультрацентрифуга на 100 000 g; центрифужные пробирки и роторы к ним для обеих центрифуг.

Прибор для лиофилизации или вакуумный эксикатор и вакуумный или водоструйный насос.

Методика

Бактериальные клетки примерно из 3 л ростовой среды центрифугируют при 10 000 g в течение 15 мин. Осадок суспендируют в 300 мл холодного физиологического раствора и снова центрифугируют. Повторяют процесс ресуспендирования и вновь центрифугируют с целью удаления компонентов среды. Отмытые бактерии лиофилизуют или хранят в морозильнике до использования.

20 г (сухого веса) бактериальных клеток тщательно суспендируют в 350 мл воды при 65—68 °С. 350 мл раствора фенола нагревают до температуры 65—68 °С и добавляют к клеточной суспензии. Смесь энергично перемешивают, выдерживают 15 мин при 65 °С, а затем охлаждают в ледяной бане до 10 °С. Эмульсию центрифугируют 30 мин при 10 000 g. При этом образуются три слоя: водный, фенольный и осадок. Иногда в фенольно-водной интерфазе образуется слой денатурированного белка. Верхний водный слой удаляют и хранят отдельно. Удаляют и отбрасывают вещества на границе раздела фаз. К фенольному слою и осадку добавляют еще 350 мл воды и тщательно перемешивают, поддерживая температуру 65—68 °С в течение 15 мин. Смесь вновь центрифугируют и верхний водный слой объединяют с водным слоем, полученным при первом центрифугировании. Водную суспензию диализуют 3—4 дня против дистиллированной воды для удаления фенола и низкомолекулярных примесей. Диализованный раствор концентрируют под вакуумом при 37 °С до 5 мл. Для этой цели удобно пользоваться роторным испарителем. Концентрированный раствор центрифугируют при 3000 g в течение 10 мин для удаления нерастворимых веществ. Осадок выбрасывают. Половину суспендированного органического вещества в надосадочной фракции составляет липополисахарид. Основной примесью является РНК. Надосадочную фракцию центрифугируют при 100 000 g в течение 1 ч. Осадок тщательно ресуспендируют в физиологическом растворе и снова центрифугируют 1 ч при 100 000 g. Центрифугирование и ресуспендирование осадка повторяют 5 раз для отмывания его от примесей. Наконец, осадок растворяют в дистиллированной воде и лиофилизуют. Если нет возможности лиофилизовать осадок, суспензию можно высушить в вакуумном эксикаторе. Из 20 г (сухого веса) биомассы бактерий сем. Enterobacteriaceae должно получаться 100—500 мг ли-пополисахарида. Этот липополисахарид представляет собой потенциальный эндотоксин [35, 39], содержащий прочно связанный липид А.

17.4.3. Выделение лнпида А и полисахарида из липополисахаридной фракции

Липид А можно выделить в виде водонерастворимо-го продукта после слабокислотного гидролиза очищенного липополисахарида. Полисахаридная часть полимера растворяется в воде.

Реактивы, материалы и оборудование

Уксусная кислота: 1%-ный (по объему) раствор готовят добавлением 1 мл уксусной кислоты к 99 мл дистиллированной воды. (Осторожно! Нельзя насасывать уксусную кислоту в пипетку ртом. Все операции выполняют в вытяжном шкафу, избегая контакта с жидкостью или парами. При работе с коицеитрированиой уксусной кислотой рекомендуется надевать защитные очки и одежду.)

Лиофилизоваииый препарат липополисахарида.

Ампулы для лиофилизации на 15 мл.

Баллон со сжатым азотом.

Вакуумный эксикатор или прибор для лиофилизации. Центрифуга иа 5000 g, 15-мл центрифужные пробирки, соответствующий ротор. Температурный контроль ие обязателен.

Методика

ОД г высушенного липополисахарида, полученного по описанной выше методике, суспендируют в 10 мл 1%-ной уксусной кислоты, через которую предварительно продували азот в течение 10 мин. Ампулу с суспензией запаивают и нагревают в паровой бане 4 ч. Затем ампулу охлаждают и открывают, а ее содержимое переносят в пробирку и центрифугируют 10 мин при 5000 g. Надосадочную фракцию, содержащую полисахаридную часть липополисахарида, осторожно отделяют от нерастворимого липида А и сохраняют для дальнейшего анализа.

Осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и снова центрифугируют. Ресуспендирование и центрифугирование повторяют 5 раз. Надосадочные фракции выбрасывают. Осадок высушивают в вакуумном эксикаторе или лиофилизуют.

Полисахарид, оставшийся в растворе после кислотного гидролиза, диализуют против 200 объемов воды и высушивают путем лиофилизации или в вакуумном эксикаторе. Из 100—500 мг липополисахарида можно получить 40—100 мг безлипидного полисахарида и 30— 150 мг липида А.

Количество липополисахарида или безлипидного полисахарида определяют с помощью тестов на 2-кето-3-дезоксиоктанат и гептозу (разд. 17.2.9). Для определения количества липида А в очищенных препаратах применяют тест на гексозамины (разд. 17.2.6).

17.5. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Наиболее широко распространенный метод определения и идентификации дезоксирибозы и рибозы нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) в клеточных экстрактах включает экстракцию и гидролиз горячим раствором ТХУ или хлорной кислоты и последующее проведение специальных колориметрических анализов для определения пентозных компонентов нуклеиновых кислот. Более удобный способ определения количества ДНК и РНК основан на их способности поглощать УФ-свет при 260 нм. Другие методи

страница 59
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(09.12.2019)