Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

ки, меньше отвечающие целям данного руководства, описаны в рекомендуемых изданиях [59, 63].

Для количественного определения нуклеиновых кислот в культурах бактерий по описанным ниже методикам необходимо, чтобы клетки присутствовали в достаточном количестве в среде, не мешающей определению, или чтобы их можно было собрать из ростовой среды, отмыть от компонентов среды, мешающих определению, и ресуспендировать в нужной концентрации в отсутствие лизиса бактерий или гидролиза нуклеиновых кислот нуклеазами. Важным условием для точного определения содержания в них нуклеиновых кислот является полная экстракция нуклеиновых кислот из клеток.

17.5Л. Определение ДНК по реакции с дифениламином

Из всех колориметрических способов определения и идентификации ДНК в сложных смесях чаще всего используют реакцию этого полимера с дифениламином в смеси уксусной и серной кислот. Химизм этой реакции и природа образующегося окрашенного соединения еще не ясны. Преимущество описываемого ниже метода Бёртона [61] заключается в его чувствительности и в том, что точному определению ДНК мешает лишь очень небольшое число веществ. Другой подобный метод описан в разд. 22.4.3.

Реактивы, материалы и оборудование

Хлорная кислота: 0,5, 1,0 и 2,5 н. растворы. (Предостережение! В нагретом состоянии {150 °С) при контакте с окисляющимися веществами хлорная кислота может воспламеняться или взрываться. Необходимо избегать попадания хлорной кислоты на кожу, в глаза и на одежду и работать с ней в вытяжном шкафу.)

Дифеииламиновый реактив: 1,5 г очищенного дифениламина, перекристаллизованного из кипящего гексаиа (белые кристаллы, ТПл = = 52,9 °С), растворяют в 100 мл перегнанной уксусной кислоты и добавляют 1,5 мл концентрированной серной кислоты (ч. д. a.; reagent grade). В день использования к каждым 20 мл дифениламииового реагента добавляют по 0,1 мл водного раствора ацетальдегида с концентрацией 16 мг/мл (1 мл ацетальдегида в 50 мл воды). (Предупреждение! Ацетальдегид очень летуч и токсичен. Необходимо работать с ним в вытяжном шкафу.)

Цитратно-солевой раствор (ЦСР): 0,15 и. NaCl+0,015 н. раствор тринатриевой соли лимонной кислоты, рН 7,0.

Стандартные растворы: имеющуюся в продаже кристаллическую ДНК растворяют в 5-Ю-3 М NaOH до концентрации 0,4 мг/мл. Стандартные растворы готовят каждые две недели. Сначала смешивают объем основного раствора ДНК с равным объемом 1 н. хлорной кислоты и смесь нагревают при 70 °С в течение 15 мин, а затем из этого раствора делают разведения 0,5 и. хлорной кислотой.

Большинство препаратов ДНК содержит по крайней мере 15% воды, поэтому при подготовке стандартных растворов трудно получить или приготовить совершенно безводную ДНК. Следует помнить о возможных неточностях, возникающих из-за использования таких препаратов ДНК в качестве стандарта. Другим способом приготовления стандартов является гидролиз ДНК и определение содержания фосфата в 1 мг ДНК [62]. Результаты выражают в микрограммах (или миллиграммах) фосфора ДНК, а не самой ДНК.

Удобным стандартом является также дезоксирибоза, приготовленная в виде водного раствора (10~3 М). Растворы можно хранить 3 мес в холодильнике. Приготовив разведения основного раствора ДНК 0,5 н. хлорной кислотой, можно построить калибровочную кривую для определения ДНК с дифениламином. При использовании таких стандартов результаты выражают в виде дезоксирибозных эквивалентов ДНК.

Спектрофотометр или колориметр и стеклянные кюветы.

Центрифуга, позволяющая работать при 10 000 g. Центрифуга должна иметь охлаждающее устройство или находиться в холодной комнате.

Центрифужные пробирки на 15 или 30 мл.

Водяная баня с температурой 70 °С и термостат или водяная баня с температурой 30 °С.

Пробирки из пирексового стекла размером 15X125 мм.

Методика

Используют суспензию, приготовленную из 5—10 мг (сухого веса) биомассы бактерий в 1 мл (~5*1010— 1-Ю11 клеток на 1 мл для бактерий, имеющих размер клеток Е. coli).

Если в культуре концентрация клеток недостаточна или если в среде присутствуют вещества, мешающие определению, то клетки собирают центрифугированием. Комплексные среды содержат компоненты нуклеиновых кислот и сахара, которые удаляются при сборе и отмывании клеток центрифугированием. Для большинства бактерий клетки собирают центрифугированием при 5000 g в течение 15 мин при 4—5°С. Осажденные клетки суспендируют в ЦСР в объеме, составляющем Ую объема культуры. Клетки центрифугируют 15 мин при 5000 g и температуре 5°С и ресуспендируют в холодном ЦСР. Если клетки растут в солевой среде и концентрация их достаточна, культуру можно использовать для выделения ДНК непосредственно.

Каждую npo6v бактериальной культуры или суспензии бактерий в ЦСР подкисляют достаточным количеством 2,5 н. хлорной кислоты до получения конечной концентрации перхлората 0,25 н. Подкисленную пробу охлаждают во льду в течение 30 мин и центрифугируют 10 мин при 10 000 g. Осадок, содержащий нуклеиновые кислоты, суспендируют в 0,5 мл 0,5 н. хлорной кислоты, помешивая стеклянной палочкой. Добавляют еще 3,5 мл 0,5 н. хлорной кислоты и нагревают суспензию 15 мин при 70°С, Во время этой процедуры следует периодически помешивать или встряхивать суспензию. Подогретую суспензию центрифугируют 10 мин при комнатной температуре при 5000 g и осторожно сливают надоса-дочную фракцию в 10-мл градуированную пробирку. Осадок вновь экстрагируют таким же образом. Объединяют оба экстракта, записывают их объемы и перемешивают.

Для проведения реакции с дифениламином различные аликвоты объединенных экстрактов смешивают с достаточным количеством 0,5 п. хлорной кислоты до получения объема 2 мл. Целесообразно из каждого экстракта готовить 10-кратные разведения (0,2 мл, 1,0 мл и

2,0 мл), для того чтобы быть уверенным в том, что интенсивность окраски будет в пределах стандартной калибровочной кривой. Доводя объемы всех проб до 2,0 мл, добавляют в каждую пробирку по 4,0 мл дифе-ниламинового реактива и тщательно перемешивают. Объем в пробирках с разведениями стандартных проб (от 5 до 100 мкг/мл) также доводят до 2,0 мл с помощью 0,5 н. хлорной кислоты и смешивают их содержимое с 4,0 мл дифениламинового реактива. Контрольную (слепую) пробу для спектрофотометра готовят, смешивая 4 мл дифениламинового реактива и 2,0 мл 0,5 н. хлорной кислоты. Пробирки инкубируют при 30 °С 16—20 ч (или в течение ночи). Если раствор в пробирках мутный, его центрифугируют при 10000 g 15 мин для удаления негидролизовавшегося белка. Измеряют оптическую плотность надосадочной фракции при 600 нм, используя для сравнения контрольную пробу (разд. 16.1.1). Концентрацию ДНК в каждой пробирке определяют по калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью стандартных растворов ДНК и концентрацией в них ДНК, дезоксирибо-зы или фосфата.

Тщательный контроль температуры не обязателен. Если все пробирки, в том числе пробирки со стандартными растворами, инкубируют при одинаковой температуре, ее значение не влияет на результаты. Калибровочную кривую получают для каждой серии определений.

17.5.2. Определение РНК по реакции с орцином

Реакция альдопентоз с подкисленным орцином, в результате которой образуется зеленый хромофор, является классической реакцией в химии Сахаров. Эта реакция позволяет определять содержание рибозы в РНК. 20% общей окраски дает дезоксирибоза. С помощью этой реакции определяют РНК или рибонуклеотиды в растворе, а также в тканях или клеточных экстрактах [62].

Реактивы и оборудование

Хлорид железа(Ш): 100 мг FeCla-6H20 растворяют в 100 мл концентрированной НС1 (ч. д. a., reagent grade), (Предостережение! См. разд. 17.3.3.)

Спиртовой раствор орцина: 6,0 г орцина растворяют в 100 мл этанола. Хранят в темной склянке. Имеющийся в продаже орцин обычно кристаллизуют из бензола. Если получают желтые кристаллы, необходима перекристаллизация.

Орциновый реактив: в день использования реактива смешивают равные объемы реактивов хлорида железа (III) и спиртового раствора орцииа. Окончательный раствор реактива должен быть ярко-желтого цвета.

Хлорная кислота и соляная кислота: 0,1 н. (Предостережение/ См. разд. 17.5.1.)

Стандартные растворы для анализа РНК. Раствор, содержащий 200 мкг/мл РНК нагревают с 0,25 н. хлорной кислотой при 70 °С в течение 30 мин. Добавляют равный объем 0,1 и. НС1 до конечной концентрации РНК 100 мкг/мл.

Предпочтительным стандартом является аденозин-5'-монофосфат (AMP), поскольку его концентрацию можно точно измерить. Раствор AMP с концентрацией 200 мкг/мл нагревают в 0,25 н. хлорной кислоте и добавляют к нему равный объем ОД н. НС1. В результате получают раствор AMP с концентрацией 100 мкг/мл.

Спектрофотометр или колориметр и стеклянные кюветы или пробирки.

Водяная баня с температурой 90 °С.

Пробирки из пирекоового стекла размером 18X125 мм.

Стеклянные шарики диаметром около 20 мм.

Методика

Готовят гидролизаты из суспензий бактериальных клеток, обрабатывая их хлорной кислотой, как описано в методике по выделению ДНК (разд, 17.5.1). Гидролизаты клеток разбавляют 0,1 н. НС1 так, чтобы они содержали от 10 до 100 мкг РНК в 1 мл. [Гидролизаты клеток из 0,8—1 мг (сухого веса) биомассы содержат около 100 мкг РНК-1 Разбавленные гидролизаты и стандарты смешивают с двумя объемами орцинового реактива, закрывают пробирки стеклянными шариками и нагревают 30 мин при 90 °С. Объемы проб зависят от типа спектрофотометра или колориметра. В большинстве случаев 1,0 мл экстрактов или стандартов смешивают с 2 мл орцинового реактива. Пробирки охлаждают в струе водопроводной воды и измеряют оптическую плотность раствора в каждой из них при 665 нм. Концентрацию РНК или нуклеотидов определяют по калибровоч17. ХИМИЧЕСКИЙ COCf АЁ

ной кривой, полученной для известных количеств AMP или РНК (разд. 16.1.1). Калибровочную кривую следует строить для каждого анализа или серии анализов. С помощью реакции с орцином можно достоверно измерить от 15 до 100 мкг РНК в экстракте бактериальных клеток.

Применяя в качестве стандарта AMP, результаты выражают в виде пуринрибозидных эквивалентов РНК.

17.5.3. Другие мето

страница 60
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.11.2019)