Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

ды определения ДНК и РНК

Чистые растворы ДНК или РНК, не содержащие белков и углеводов, можно анализировать методом УФ-спектроскопии (разд. 22.4.1). Раствор, содержащий 1 мг чистой нуклеиновой кислоты в 1 мл, имеет оптическую плотность при 260 нм ~22—23.

Помимо колориметрического анализа ДНК в клетках и тканях существует еще один быстрый и чувствительный способ, описанный Цаном [63]. Он основан на определении тимина в гидролизатах клеток с помощью газовой хроматографии. Недостаток этого способа в том, что он требует наличия газового хроматографа. Если измерения ДНК проводят ежедневно, то применение газового хроматографа в этом случае оправданно из-за экономии времени.

Применение методики

Описанная выше методика позволяет выделять около 95% нуклеиновых кислот из бактериальных клеток и эндоспор. Если же с ее помощью не удается полностью экстрагировать нуклеиновые кислоты, о чем можно судить по наличию ДНК в растворимой фракции после третьей экстракции осадка, то в этом случае применяют другой способ экстракции. Он заключается в обработке клеток 5%-ной (вес/объем) ТХУ с нагреванием в течение 15 мин при 90°С. Экстракт разбавляют до требуемого объема 5%-ным трихлорацетатом и анализируют по описанной выше методике.

Если нужно определить концентрацию очищенной ДНК в растворе, пробы обрабатывают один раз 0,5 н. НСЮ4 при 70°С в течение 15 мин. Пробы с обрабо

тайной ДНК анализируют по реакции с дифениламином, как описано выше. При низких концентрациях ДНК осаждение нуклеиновой кислоты охлажденной хлорной кислотой приводит к относительно большим потерям. Поэтому в случае чистых растворов ДНК этот этап проводить не следует. При необходимости осаждения ДНК из разбавленных растворов с целью ее отделения от мешающих определению веществ, например нуклеотидов, в каждую пробирку можно добавить 100 мкг бычьего сывороточного альбумина в качестве соосадителя. Этот прием способствует лучшему осаждению ДНК.

Колориметрия и УФ-спектрофотометрия применимы в случае любых РНК. Все РНК имеют одинаковый коэффициент экстинкции при колориметрическом определении. В присутствии белков, полисахаридов и многих других веществ, поглощающих УФ-свет (в том числе фенола, который часто применяется при выделении нуклеиновых кислот), точность УФ-спектрофотометрическо-го анализа снижается. Отклонения от нормального спектра свидетельствуют о загрязнении белком, углеводом или другими соединениями.

При определении РНК с орцином анализу мешают гексозы, дающие коричневую окраску. Поэтому определение количества РНК в сахарозных градиентах или в растворах, содержащих гексозы или их полимеры, лучше всего проводить с помощью УФ-спектрометрии.

Преимуществом УФ-спектрометрии является то, что при ее применении не происходит разрушения вещества, а это существенно при наличии небольших количеств нуклеиновых кислот. Важно также и то, что она проста и удобна на практике.

Если известно количество клеток в единице объема, можно рассчитать количество ДНК на клетку по содержанию ДНК в суспензии и на основе этих данных — размер генома бактерии [59].

17.6. АЗОТСОДЕРЖАЩИЕ СОЕДИНЕНИЯ

Выбор наиболее подходящего метода анализа азота в каком-либо соединении зависит от вида анализируемого азота, его концентрации и наличия мешающих определению веществ. Наиболее распространенный способ определения нитритного азота включает модификацию диазотирования и связанных с ним реакций. Для определения нитратного, аммонийного, а также органического азота применяют другие методы. В табл. 17.1 сравнивается чувствительность некоторых методов и указаны случаи их применения. Ниже мы опишем наиболее простые и вместе с тем широко применяемые методы анализа азота в различных содержащих его соединениях. Ссылки на литературу, содержащую описание других методов, приведены в табл. 17.1.

Ввиду разнообразия веществ, которые можно проверять на содержание азота (например, молоко, удобрения, почва, материалы растительного и животного происхождения), многие методы, перечисленные в табл. 17.1, приходится модифицировать или же необходимо проводить предварительную обработку пробы, так чтобы ее можно было использовать в условиях анализа. Описано много вариантов методик, приведенных здесь полностью или только перечисленных; поэтому, обратившись к литературе, можно выбрать метод, подходящий для данного образца.

17.6.1. Нитрит (см. также разд. 16.2.2)

Анализ нитритного азота основан на реакции N02~ с сульфаниламидом в кислой среде с образованием ди-азосоединения. Последнее реагирует с г^-(1-нафтил)-этилендиамином, образуя краситель, поглощающий свет при 543 нм [73, 80]. Указанные реактивы можно заменить сульфаниловой кислотой и а-нафтиламином, однако последний признан канцерогеном и должен применяться под строгим контролем.

С помощью этой реакции можно определять до 1 мкг/л NO2" при толщине кюветы 10 см. Поглощение окрашенного соединения подчиняется закону Ламберта— Бэра (разд. 16.1.1) до концентрации N02" 180 мкг/л [68]. Ионы, вызывающие осаждение N02"" и, следовательно, мешающие определению, перечислены в табл. 17.1. В их присутствии необходимо применять другой метод обнаружения N02", например его восстановление и последующий анализ NH4+. Как и при любом

Таблица

17.1. Сравнение

аналитических методов определения азота

Соединение азота

Аналитический метод

Минимальные количества азота

Вещества, мешающие определению

Основные достоинства

Основные недостатки

Источник данных

Диазотирова-ние

Восстановление до NH4+ горячей щелочью или салициловой кислотой с последующим анализом NHs" Другие методы6 Восстановление до N02-с последующим анали зом на NC>2~'

1 мкг/л

>2 мг/л

С1~, окрашенные вещества, взвешенные частицы, ионы Sb, Bi, Fe(III), Pb, Hg, Ag, соли Си (III), Au, хлорпла-тннат, мета-ванадат

NOs-, NH4+

Простота

Удобно при fN02l> >2000 мкг/л

Мешает присутствие С1~ и Fe3+

Применение горячей щелочи, не обходнмость пе регоики, образо ваиие N02~+ + NO3- + NH4+

[64, 68, 73, 80, 92]

[61, 62, 68, 701

[97, 104]

о:

Восстановление Cd—Си

Восстановление Cd—Hg

Восстановление Zn

Измерение оптической плотности прн 220 нм

Метод с исполь зованнем бру-цина

Восстановление до 95%

То же

Восстановление >95%°

40 мкг/л

100 мкг/л

[S2"]>2 мг/л может активировать колонки

То же

Многие органические соединения, N02~, ПАВ, хромат6-, окрашенные вещества

Окрашенные вещества, взвешенные частицы, сильные окислители, сильные восстановители, NO2-, органические вещества в высокой концентрации, Q-, но ны Fe, Мп4+

Быстрое восстановление прн наличии приготовленной колонки

То же

Не требуется приготовления колонки

Простота

Приготовление колонки

Приготовление ко лонки, использование Hg

Большее время восстановления

Необходимость УФ-спектрофо-тометра, помехи за счет многих органических соединений

Бруцнн — высоко токсичный алкалоид (его необходимо взвешивать в вытяжном шкафу); низкая чувстви тельность; поме хи за счет окис лнтелен и вое становителей

[73]

[68] [81, 92] [68]

[68]

х

К S S

л

m о

К

я

о о о и >

Продолжение табл. 17.1.

Соединение азота

Аналитический метод

Минимальные количества азота

Вещества, мешающие определению

Основные достоинства

Основные недостатки

Источник данных

Метод с исполь зованием хро мотроповой кислоты

Нитрофенол-дисульфоно-вый метод

Восстановление до NH4 + горячей щелочью или салициловой кислотой с последующим анализом \Н4+

100 мкг/л

20 мкг/л

>2 мг/л

Окрашенные ве щества, взвешенные частицы, Ва, РЬ, Sr, иодид, ио дат, селенит, селенат, хромат

Органические вещества, ОN0,

NO,-, NH.+

Окраска устойчива в тсче ние 24 ч

Простой и прямой метод

Удобно, когда азота в N03->2 мг/л

Низкая чувствительность

Необходимость сушки, помехи за счет органических соединений

Для приготовления реагентов необходимо кипячение H2SO4

Использование горячей щелочи, необходимость перегонки, образование NOa_ + + N02 -fNH4+

[68]

[64, 65, 93, 100]

164, 65,

68, 84J

Другие методы'

Окисление0 до N02~ с последующим анализом N02Использоваиие индофенол о-вого синего (известного также как феиат)

Применение раствора Нес-слера

10 мкг/л

20 мкг/л

Аминокислоты, атмосферный NH3

Взвешенные ча стицы, окрашенные вещества, избыток кислоты или щелочи, соединения азота с низкой молекулярной массой

Взвешенные ча стицы, окра шенные ве щества, ионы Mg, Fe, Са, S. Мп, С1, низкомолеку лярные органические соединения

Не требуется перегонки

Простота; иаи более предпочтительный колориметри ческий метод после метода Кьельдаля

Удобно для рас творов образцов в чистой воде

Выделение N02~ из некоторых аминокислот

Может потребоваться предварительная перегонка; применение фенола; неустойчивость реактивов

Может потребо ваться предварительная перегонка; применение Hg

[70, 75, 76, 84, 103, 104] [73]

[64, 68, 99]

[64, 68]

Продолжение табл. 17.1.

Соединение азота

Аналитический метод

Минимальные количества азота

Вещества, мешающие определению

Основные достоинства

Основные недостатки

Источник данных

Суммарный органический азот

Ацидиметриче-ский метод

Пнридин-пира-золовый способ

Метод Кьельда ля с последующим аиа лизом на NH4+ или окисление до, N02~ и аиа лиз иа N02~°

2 мкг/л

50 мкг/л

С1Ионы Fe, Zn, Ag, Си, циа-нат

NH4+ (определяют отдельно и вычитают или отгоняют)

После этапа перегонки методика проста; удобна при высоком содержании NH4; наиболее предпочтительный метод после метода Кьель-даля

Специфичен для

NH4+

Количественное определение

Необходимость перегонки

Использование пиридина

иеоб пе-обра паров

Использование Hg (см. работы,

указанные

ссылках),

ходимость

регонкн,

зованне

H2S04

[64, 68, 70]

[73, 88]

[64, 65, 66, 68, 70, 71, 73, 79, 98]

CiO

Азот белка

Метод Лоури

Биуретовый метод

УФ-Спектро-фотометрия

Связывание с красителем

Флуориметри-ческий анализ

30 мг/л

1 г/л

10 мг/л

30 мг/л

5 мкг/л

Аминок

страница 61
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.09.2019)