|
|
Методы общей бактериологии. Том 2ды определения ДНК и РНК Чистые растворы ДНК или РНК, не содержащие белков и углеводов, можно анализировать методом УФ-спектроскопии (разд. 22.4.1). Раствор, содержащий 1 мг чистой нуклеиновой кислоты в 1 мл, имеет оптическую плотность при 260 нм ~22—23. Помимо колориметрического анализа ДНК в клетках и тканях существует еще один быстрый и чувствительный способ, описанный Цаном [63]. Он основан на определении тимина в гидролизатах клеток с помощью газовой хроматографии. Недостаток этого способа в том, что он требует наличия газового хроматографа. Если измерения ДНК проводят ежедневно, то применение газового хроматографа в этом случае оправданно из-за экономии времени. Применение методики Описанная выше методика позволяет выделять около 95% нуклеиновых кислот из бактериальных клеток и эндоспор. Если же с ее помощью не удается полностью экстрагировать нуклеиновые кислоты, о чем можно судить по наличию ДНК в растворимой фракции после третьей экстракции осадка, то в этом случае применяют другой способ экстракции. Он заключается в обработке клеток 5%-ной (вес/объем) ТХУ с нагреванием в течение 15 мин при 90°С. Экстракт разбавляют до требуемого объема 5%-ным трихлорацетатом и анализируют по описанной выше методике. Если нужно определить концентрацию очищенной ДНК в растворе, пробы обрабатывают один раз 0,5 н. НСЮ4 при 70°С в течение 15 мин. Пробы с обрабо тайной ДНК анализируют по реакции с дифениламином, как описано выше. При низких концентрациях ДНК осаждение нуклеиновой кислоты охлажденной хлорной кислотой приводит к относительно большим потерям. Поэтому в случае чистых растворов ДНК этот этап проводить не следует. При необходимости осаждения ДНК из разбавленных растворов с целью ее отделения от мешающих определению веществ, например нуклеотидов, в каждую пробирку можно добавить 100 мкг бычьего сывороточного альбумина в качестве соосадителя. Этот прием способствует лучшему осаждению ДНК. Колориметрия и УФ-спектрофотометрия применимы в случае любых РНК. Все РНК имеют одинаковый коэффициент экстинкции при колориметрическом определении. В присутствии белков, полисахаридов и многих других веществ, поглощающих УФ-свет (в том числе фенола, который часто применяется при выделении нуклеиновых кислот), точность УФ-спектрофотометрическо-го анализа снижается. Отклонения от нормального спектра свидетельствуют о загрязнении белком, углеводом или другими соединениями. При определении РНК с орцином анализу мешают гексозы, дающие коричневую окраску. Поэтому определение количества РНК в сахарозных градиентах или в растворах, содержащих гексозы или их полимеры, лучше всего проводить с помощью УФ-спектрометрии. Преимуществом УФ-спектрометрии является то, что при ее применении не происходит разрушения вещества, а это существенно при наличии небольших количеств нуклеиновых кислот. Важно также и то, что она проста и удобна на практике. Если известно количество клеток в единице объема, можно рассчитать количество ДНК на клетку по содержанию ДНК в суспензии и на основе этих данных — размер генома бактерии [59]. 17.6. АЗОТСОДЕРЖАЩИЕ СОЕДИНЕНИЯ Выбор наиболее подходящего метода анализа азота в каком-либо соединении зависит от вида анализируемого азота, его концентрации и наличия мешающих определению веществ. Наиболее распространенный способ определения нитритного азота включает модификацию диазотирования и связанных с ним реакций. Для определения нитратного, аммонийного, а также органического азота применяют другие методы. В табл. 17.1 сравнивается чувствительность некоторых методов и указаны случаи их применения. Ниже мы опишем наиболее простые и вместе с тем широко применяемые методы анализа азота в различных содержащих его соединениях. Ссылки на литературу, содержащую описание других методов, приведены в табл. 17.1. Ввиду разнообразия веществ, которые можно проверять на содержание азота (например, молоко, удобрения, почва, материалы растительного и животного происхождения), многие методы, перечисленные в табл. 17.1, приходится модифицировать или же необходимо проводить предварительную обработку пробы, так чтобы ее можно было использовать в условиях анализа. Описано много вариантов методик, приведенных здесь полностью или только перечисленных; поэтому, обратившись к литературе, можно выбрать метод, подходящий для данного образца. 17.6.1. Нитрит (см. также разд. 16.2.2) Анализ нитритного азота основан на реакции N02~ с сульфаниламидом в кислой среде с образованием ди-азосоединения. Последнее реагирует с г^-(1-нафтил)-этилендиамином, образуя краситель, поглощающий свет при 543 нм [73, 80]. Указанные реактивы можно заменить сульфаниловой кислотой и а-нафтиламином, однако последний признан канцерогеном и должен применяться под строгим контролем. С помощью этой реакции можно определять до 1 мкг/л NO2" при толщине кюветы 10 см. Поглощение окрашенного соединения подчиняется закону Ламберта— Бэра (разд. 16.1.1) до концентрации N02" 180 мкг/л [68]. Ионы, вызывающие осаждение N02"" и, следовательно, мешающие определению, перечислены в табл. 17.1. В их присутствии необходимо применять другой метод обнаружения N02", например его восстановление и последующий анализ NH4+. Как и при любом Таблица 17.1. Сравнение аналитических методов определения азота Соединение азота Аналитический метод Минимальные количества азота Вещества, мешающие определению Основные достоинства Основные недостатки Источник данных Диазотирова-ние Восстановление до NH4+ горячей щелочью или салициловой кислотой с последующим анализом NHs" Другие методы6 Восстановление до N02-с последующим анали зом на NC>2~' 1 мкг/л >2 мг/л С1~, окрашенные вещества, взвешенные частицы, ионы Sb, Bi, Fe(III), Pb, Hg, Ag, соли Си (III), Au, хлорпла-тннат, мета-ванадат NOs-, NH4+ Простота Удобно при fN02l> >2000 мкг/л Мешает присутствие С1~ и Fe3+ Применение горячей щелочи, не обходнмость пе регоики, образо ваиие N02~+ + NO3- + NH4+ [64, 68, 73, 80, 92] [61, 62, 68, 701 [97, 104] о: Восстановление Cd—Си Восстановление Cd—Hg Восстановление Zn Измерение оптической плотности прн 220 нм Метод с исполь зованнем бру-цина Восстановление до 95% То же Восстановление >95%° 40 мкг/л 100 мкг/л [S2"]>2 мг/л может активировать колонки То же Многие органические соединения, N02~, ПАВ, хромат6-, окрашенные вещества Окрашенные вещества, взвешенные частицы, сильные окислители, сильные восстановители, NO2-, органические вещества в высокой концентрации, Q-, но ны Fe, Мп4+ Быстрое восстановление прн наличии приготовленной колонки То же Не требуется приготовления колонки Простота Приготовление колонки Приготовление ко лонки, использование Hg Большее время восстановления Необходимость УФ-спектрофо-тометра, помехи за счет многих органических соединений Бруцнн — высоко токсичный алкалоид (его необходимо взвешивать в вытяжном шкафу); низкая чувстви тельность; поме хи за счет окис лнтелен и вое становителей [73] [68] [81, 92] [68] [68] х К S S л m о К я о о о и > Продолжение табл. 17.1. Соединение азота Аналитический метод Минимальные количества азота Вещества, мешающие определению Основные достоинства Основные недостатки Источник данных Метод с исполь зованием хро мотроповой кислоты Нитрофенол-дисульфоно-вый метод Восстановление до NH4 + горячей щелочью или салициловой кислотой с последующим анализом \Н4+ 100 мкг/л 20 мкг/л >2 мг/л Окрашенные ве щества, взвешенные частицы, Ва, РЬ, Sr, иодид, ио дат, селенит, селенат, хромат Органические вещества, ОN0, NO,-, NH.+ Окраска устойчива в тсче ние 24 ч Простой и прямой метод Удобно, когда азота в N03->2 мг/л Низкая чувствительность Необходимость сушки, помехи за счет органических соединений Для приготовления реагентов необходимо кипячение H2SO4 Использование горячей щелочи, необходимость перегонки, образование NOa_ + + N02 -fNH4+ [68] [64, 65, 93, 100] 164, 65, 68, 84J Другие методы' Окисление0 до N02~ с последующим анализом N02Использоваиие индофенол о-вого синего (известного также как феиат) Применение раствора Нес-слера 10 мкг/л 20 мкг/л Аминокислоты, атмосферный NH3 Взвешенные ча стицы, окрашенные вещества, избыток кислоты или щелочи, соединения азота с низкой молекулярной массой Взвешенные ча стицы, окра шенные ве щества, ионы Mg, Fe, Са, S. Мп, С1, низкомолеку лярные органические соединения Не требуется перегонки Простота; иаи более предпочтительный колориметри ческий метод после метода Кьельдаля Удобно для рас творов образцов в чистой воде Выделение N02~ из некоторых аминокислот Может потребоваться предварительная перегонка; применение фенола; неустойчивость реактивов Может потребо ваться предварительная перегонка; применение Hg [70, 75, 76, 84, 103, 104] [73] [64, 68, 99] [64, 68] Продолжение табл. 17.1. Соединение азота Аналитический метод Минимальные количества азота Вещества, мешающие определению Основные достоинства Основные недостатки Источник данных Суммарный органический азот Ацидиметриче-ский метод Пнридин-пира-золовый способ Метод Кьельда ля с последующим аиа лизом на NH4+ или окисление до, N02~ и аиа лиз иа N02~° 2 мкг/л 50 мкг/л С1Ионы Fe, Zn, Ag, Си, циа-нат NH4+ (определяют отдельно и вычитают или отгоняют) После этапа перегонки методика проста; удобна при высоком содержании NH4; наиболее предпочтительный метод после метода Кьель-даля Специфичен для NH4+ Количественное определение Необходимость перегонки Использование пиридина иеоб пе-обра паров Использование Hg (см. работы, указанные ссылках), ходимость регонкн, зованне H2S04 [64, 68, 70] [73, 88] [64, 65, 66, 68, 70, 71, 73, 79, 98] CiO Азот белка Метод Лоури Биуретовый метод УФ-Спектро-фотометрия Связывание с красителем Флуориметри-ческий анализ 30 мг/л 1 г/л 10 мг/л 30 мг/л 5 мкг/л Аминок |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 |
Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |