Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

, которые вообще не растут при добавлении любого набора метаболитов, могут быть 1) мутантами, нуждающимися в таком веществе (например, витамине), которое не вошло ни в один из наборов, или 2) двойными мутантами, зависящими от сочетания двух метаболитов, не вошедших ни в один из наборов. Такие мутанты можно проверить на чашках с добавлением смеси витаминов, или гидролизатов РНК, или полной смеси аминокислот (например, кислотного гидролизата казеина, или казаминовых кислот, с L-триптофаном). Если выделяют ауксотрофы, которые не отвечают ни на один из предлагаемых наборов, можно попробовать другие добавки, такие, как смеси витаминов, аминокислот или гидролизаты нуклеиновых кислот [16].

13.7. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ МУТАНТОВ

Когда мутант наконец выделен, часто желательно провести биохимические и генетические исследования, чтобы иметь информацию о природе его генетического дефекта. Например, потребность в питательном веществе может быть вызвана мутациями в нескольких генах. Так, ауксотрофы, не способные синтезировать опредеТаблица 13.3. Комбинации добавок к минимальному агаруа

Номер набора 1 2 со 4 5

6 7 8

9 Аденин Гистидин Фенилала-нин

Глутамино-вая кислота Гуанин Лейцин Тирозин

Серии Цистеин

Изолейцин

Триптофан

Алании Метионин В а лин Треонин

Аспарагино-вая кислота Витамин В)

Лизин

Пролин

Аргннин

Все вещества, кроме витамина Вь добавляют в конечной концентрации 20 мкг/мл, витамин Bi — в конечной концентрации 4 мкг/мл.

ленную аминокислоту, могут иметь нарушения в одной из нескольких последовательных ферментативных реакций, ведущих к синтезу этой аминокислоты. Морфологические мутанты или мутанты с изменениями в синтезе макромолекул могут иметь модификации в еще более широком классе функций, например на этапе сборки или регуляции.

Хотя в задачу настоящей главы не входит детальное описание множества возможных подходов к изучению природы мутантов, ниже приводится несколько основных способов анализа, которые могут быть полезны в работе.

13.7.1. Природа изменений ДНК

Некоторые представления о природе изменений ДНК часто можно получить с помощью анализа обратных мутаций, описанного в разд. 13.5.2. Если обратная мутация вызывается любым мутагеном, можно заключить, что это точковая мутация, а не делеция или другая хромосомная аберрация. Если обратная мутация ускоряется аналогами оснований, ЭМС или гидроксиламином, возможен предварительный вывод о замене оснований, вероятно, по типу транзиций. Если же скорость обратной мутации возрастает под действием такого мутагена, как ICR-191, то скорее всего мутация представляет собой сдвиг рамки. Ускорение обратной мутации такими факторами, как ультрафиолет, при отсутствии эффекта других мутагенов указывает на мутацию по типу трансверсии (см. предупреждение в разд. 13.2). Частота спонтанной реверсии—также важный параметр, так как он является мерой генетической стабильности мутации. Это свойство может быть важным критерием в оценке пригодности данной мутации для последующих физиологических или биохимических исследований.

13.7.2. Полнота генетического блока

Второй критерий, определяющий ценность отдельной мутации —это степень инактивации гена, в котором произошла мутация. Частичное сохранение функции часто встречается в случае мутации с заменой оснований и значительно реже при сдвигах рамки или делециях. Степень полноты мутации легко оценить по скорости роста или другим проявлениям свойств, высевая клетки мутанта с низкой плотностью на селективную или непермис-сивную среду. Неполнота мутации может стать проблемой в работе с мутантами, которые должны использоваться в других физиологических экспериментах, связанных, например, с исследованием активности ферментов, или в сопряженных с другими мутантами тест-системах.

13.7.3. Физиологические механизмы

генетического блока

Для мутантов, дефектных по одному из нескольких генов, которые кодируют ферменты, участвующие в одной цепи биохимических реакций, природу дефекта часто можно выяснить, сопоставляя зависимость роста от тех или иных факторов с накоплением промежуточных продуктов. В идеальном случае для любой последователь12 3 п

ности биохимических реакций X—кА—>Ъ——>-КП

1з. МУТАЦИЙ

(X, А, В, С — промежуточные продукты, КП — конечный продукт) мутанты, заблокированные на любом из этапов, должны отвечать (т. е. расти) на любой способный продиффундировать в клетку промежуточный продукт реакции, образующийся за местом блока. При этом промежуточные продукты, образующиеся непосредственно перед местом блока, будут накапливаться в ростовой среде. Так, для приведенной гипотетической последовательности мутант по гену, кодирующему фермент 1, будет накапливать промежуточный продукт X и расти при добавлении продуктов А, В или С, не говоря уже о КП. Мутант, дефектный по ферменту 2, будет накапливать промежуточный продукт А (и, возможно, X) и расти при добавлении В, С или КП.

На практике изучение природы мутантов по накоплению продуктов и по выявлению зависимости роста от добавок ограничено несколькими факторами. Во-первых, многие продукты не могут проникнуть в клетку. Обычно, например, клеткам недоступны фосфорилированные промежуточные продукты, которые, таким образом, не могут использоваться для нормализации роста путем добавления к среде (обычно они синтезируются внутри клетки). Во-вторых, некоторые промежуточные продукты химически нестабильны и быстро деградируют до других соединений, некоторые метаболизируются другими ферментными системами. В-третьих, нужные промежуточные продукты иногда малодоступны или отсутствуют простые методы их выявления (например, невозможно колориметрическое определение и др.). Несмотря на указанные ограничения, исследование зависимости роста от добавления промежуточного продукта и накопления соответствующего продукта может оказаться чрезвычайно полезным при идентификации различных генетических и ферментативных функций в биосинтезе аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований и витаминов.

13.8. СПЕЦИАЛЬНЫЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

Индукция мутаций и выделение мутантов — важные этапы, лежащие в основе использования мутантов тем или иным способом. В последние годы широкое распро

странение и значение приобрели две специальные разновидности применения мутагенеза. Это метод локального мутагенеза, позволяющий специфично получать мутации в ограниченном участке бактериального генома, и проба на мутагенез по Эймсу, при помощи которой можно выявить потенциальную канцерогенную активность неизвестного вещества, измерив его мутагенность в бактериальной тест-системе.

13.8.1. Локальный/мутагенез

Метод локального мутагенеза, предложенный в 1971 г. Хонгом и Эймсом [13], позволяет выделять мутанты с вновь индуцированными мутациями, локализованными в небольшой области бактериальной хромосомы. Мутации индуцируются в коротком отрезке ДНК бактерии, который содержится в трансдуцирующем бактериофаге, и затем обнаруживаются в клетках, подвергшихся трансдукции, отбором по близко сцепленному маркеру. Таким способом можно селективно получать мутации в области, составляющей около 1 % бактериальной хромосомы.

В приводимом ниже описании метода осуществляющий общую трансдукцию фаг PI Е. coll подвергают мутагенезу обработкой гидроксиламином, химическим агентом, который производит транзиций типа GC—кАТ. После этого фаг используют для трансдукции реципи-ентного штамма, имеющего генетический дефект на одном из ранних этапов биосинтеза ароматических аминокислот (агоЕ). Трансдуктанты проверяются затем на наличие новых мутаций либо в одном из близко расположенных генов устойчивости к лекарственным препаратам (стрептомицин или спектиномицин), либо в различных генах рибосомных белков. Последние мутации легко выявляются как температурочувствительные условно летальные мутации [14].

Метод приготовления трансдуцирующего бактериофага

1. Смешивают около 106 частиц фага PI vir с 0,5 мл культуры (1—2-108 клетка/мл) дикого штамма Е. coll (агоЕ+), находящегося в середине логарифмической фазы роста в L-бульоне (разд. 13.9.1). Это делают в пробирке, куда предварительно вносят 3 мл расплавленного и остуженного LC-arapa (разд. 13.9.17), используемого затем для формирования верхнего слоя среды в чашке.

2. Выливают смесь на поверхность свежеприготовленного нижнего слоя LC-arapa (разд. 13.9.18) в чашки и инкубируют в течение ночи при 37 °С.

3. Снимают верхний слой агара стерильной лопаточкой в пробирку с завинчивающейся крышкой, содержащей 0,5 мл хлороформа.

4. Промывают поверхность оставшегося в чашке агара 2 мл L-бульона (разд. 13.9.1), добавляют смыв к собранному в пробирку агару и интенсивно встряхивают.

5. Смесь центрифугируют при 5000—6000 g на настольной центрифуге в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляют пастеровской пипеткой и переносят в стерильную пробирку с несколькими каплями хлороформа.

Метод титрования и мутагенеза трансдуцирующего фага

1. Выращивают культуру Е. coll АВ1157 до приблизительной концентрации 2-108 клетка/мл в L-бульоне (разд. 13.9.1), центрифугируют и ресуспендируют полученные клетки в половине объема L-бульона.

2. Смешивают 0,1 мл этой клеточной суспензии с 0,1 мл разных разведений фаголизата (Ю-5, 10~6, Ю-7) в L-бульоне. Для обеспечения адсорбции фага инкубируют пробы 20 мин при 37 °С.

3. Добавляют 1,5 мл расплавленного LC-arapa (разд. 13.9.17), охлажденного до температуры 55 °С, смешивают быстрым вращением пробирки между ладонями и выливают в чашки на поверхность свежеприготовленного и застывшего нижнего слоя LC-arapa (разд. 13.9.18).

4. Инкубируют чашки в течение ночи при 37 °С и на следующий день подсчитывают число стерильных пятен.

5. Концентрируют фаг, находящийся в лизате, центрифугированием при 48 000 g в течение 3 ч.

6. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в небольшом объеме L-бульона и оставляют на ночь при 4°С.

7. На следующий день суспензию центрифугируют при 15 000 g в течение 10 мин и осадок удаляют.

8. Вновь титруют раствор с фагом, как это было сделано ранее на этапах с 2-го по 4-й.

9. Концентрированную суспензию с фагом (10

страница 7
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(09.12.2019)