Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

дыхательной цепи, ассоциированным с формиатдегидрогеназой и цитохромом Ь. Индукция его синтеза происходит в условиях анаэробного роста, при которых ЫОз~ может служить акцептором электронов при анаэробном дыхании. Ферментативную активность разрушенных клеток определяют при наличии соответ-С1В>ющего восстановителя (например, метилвиологена). Ниже приведена методика, разработанная Лоу и Эван-сом [27], краткое описание которой содержится в Worthington Enzyme Manual [9].

Для приготовления контрольной пробы берут равные объемы (0,1 мл) 0,15 М фосфата калия, рН 7,0, 0,02%-ного метилвиологена и свежеприготовленного на дистиллированной воде (перегнанной с помощью стеклянного дистиллятора) раствора, содержащего 23 мМ дитионит натрия и 48 мМ бикарбонат натрия. При температуре 30 °С к контрольной пробе и опытной пробе (содержащей вместо воды 0,1 мл 0,10 М нитрата натрия) добавляют фермент. Реакцию останавливают усиленной аэрацией (до полного исчезновения синей окраски). Количество образовавшегося нитрита определяют колориметрически следующим образом. К 0,4 мл анализируемой смеси быстро добавляют 0,5 мл 58 мМ сульфаниламида (приготовленного в 3 н. HQ) и 0,5 мл 0,39 мМ N-(1-нафтил)этилендиамингидрохлорида. Добавляют 1,5 мл воды и инкубируют при комнатной температуре 10 мин. Измеряют оптическую плотность при 540 нм, используя в качестве слепой контрольную пробу. Количество микромолей образовавшегося N02~ находят по ранее построенной калибровочной кривой.

18.2.5. Оксидоредуктазы (сукцинатдегидрогеназа)

Сукцинатдегидрогеназа [КФ 1.3.99.1, сукцинат: (акцептор) оксидоредуктаза] катализирует окисление сук-цината через ряд акцепторов электронов с помощью следующей окислительно-восстановительной реакции:

Сукцинат + Акцептор *? Фумарат -|- Восстановленный акцептор.

Сукцинатдегидрогеназа — это связанный с мембраной флавопротеиновый компонент цикла трикарбоновых кислот. Он функционирует только в аэробных условиях, а его синтез частично находится под контролем сАМР, по крайней мере у Е. coll. Активность фермента в разрушенных клетках или очищенных мембранных препаратах определяют с помощью непрерывного спектрофотометри-ческого анализа (1), включающего восстановление цитохрома с.

Сукцинат -\- Феназинметосульфат (ФМС) *- Фумарат + ФМСН2;

ФМСН2 + Цитохром с (окисленный) * ФМС-f-Цитохром с

(восстановленный).

Скорость восстановления цитохрома измеряют с помощью однолучевого спектрофотометра при 550 нм. Кривая оптической плотности регистрируется на ленточном самописце.

Реакционная смесь состоит из 50 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера, рН 7,6, 2,5 мл 1М сукцината. 10 мл 0,01 М ЭДТА, рН7,6, 0,75 мл KCN (5,8 мг/мл) и 42,5 мл дистиллированной воды. 2,5 мл этой смеси вносят в пробирку, содержащую от 5 до 100 мкл фермента, и инкубируют 15 мин при 23 °С. 1,95 мл этого раствора переносят в кювету, добавляют 15 мкл цитохрома с (тип III Sigma, из сердца лошади, 250 мг/2,4 мл) и перемешивают. Спектрофотометр устанавливают на нуль, регулируя ширину щели. Реакцию начинают добавлением 25 мкл феназинметосульфата (ФМС; водный свежеприготовленный раствор с концентрацией 12 мг/мл, который хранят в темной склянке). Эксперимент проводят в затемненной комнате. Скорость реакции находят по наклону кривой оптической плотности, записываемой самописцем (изменение оптической плотности [АА] в 1 мин). Единицу активности сукцинатдегидрогеназы выражают в микромолях цитохрома с, восстанавливаемого в 1 мин (AA-f-коэффициент экстинкции 8550 = 29,9) в этих условиях. Вместо цитохрома с в подобном эксперименте можно использовать 2,6-дихлорфенолиндофенол.

18.2.6. Трансферазы (фосфофруктокиназа)

Фосфофруктокиназу (КФ 2.7.1.11, АТР : D-фруктозо-6-фосфат 1-фосфотрансферазу) можно определять па-следующей методике, разработанной для дрожжевой фосфофруктокиназы {43]. Непрерывно спектрофотомет-рируют реакционную смесь, в которой протекают следующие трансферазные реакции:

Фруктозо-6-фосфат (Ф-6-Ф) -\- GTP ** Фруктозо-1,6-дифосфат

(Ф-Д-Ф) + GDP

Альдолаза

Ф-Д-Ф > Глицеральдегид-З-фосфат (Г-З-Ф) -f Дигидроксиацетонфосфат (ДАФ)

Г-З-Ф ДАФ

2ДАФ + 2ЫАОН *? 2 Глицерол-ЗФ + 2NAD

ф-6-Ф -1- GTP + 2NADH * GDP + 2 Глицерол-З-Ф + 2NAD.

<ЗТР используют вместо АТР, вызывающего аллостери-ческое ингибирование. В состав реакционной смеси входят (указаны конечные концентрации): 1 мМ Ф-6-Ф, 1 мМ GTP, 5 мМ MgCl2, 25 мМ фосфат калия, рН 6,5, 5 мМ этантиол, 0,15 мМ NADH, 0,1 ед./мл альдолазы, 1 ед. (в 2 мл) глицеролфосфатдегидрогеназы, 1,5 ед./мл триозофосфатизомеразы. За окислением внесенного NADH наблюдают в кювете (с длиной оптического пути 1 см), содержащей 2,0 мл смеси. Реакцию начинают добавлением фосфофруктокиназы (не более 10~2 ед. фермента) и наблюдают за ней по снижению оптической плотности при 340 нм. В каждом эксперименте, особенно с неочищенными препаратами, готовят контрольную пробу без GTP для определения активности NADH-ok-сидазы. Значение оптической плотности в контрольной пробе вычитают из соответствующего значения опытной пробы.

При количественном анализе аллостерической регуляции с помощью АТР, ADP и АМР в неочищенных экстрактах, содержащих глюкозофосфатизомеразу, важно не допускать значительных изменений концентрации Ф-6-Ф в результате изомеризации. Для этого можно добавить 0,2 М нейтрализованный раствор глюкозо-6-фос-фата (Г-6-Ф) и 20 ед. Г-6-Ф-изомеразы на 1 мл. В течение 1 ч при комнатной температуре в растворе будут находиться 0,05 М Ф-6-Ф и 0,15 М Г-6-Ф. За международную единицу принято количество фермента, которое фосфорилирует 1 мкмоль Ф-6-Ф в 1 мин в описанных выше условиях при 25 °С [ДА34<г^-2ч-6,22-103= (микромоли в 1 мл)-2 = микромоли на кювету].

АТР является субстратом и аллостерическим ингибитором фосфофруктокиназы, и его действие зависит от концентрации Ф-6-Ф. АМР снимает ингибирующее действие АТР. Цитрат также является ингибитором, особенно в присутствии АТР, a NH4, напротив, активирует фермент.

18.2.7. Трансферазы (орнитин — карбамоилтрансфераза)

Орнитин — карбамоилтрансфераза (КФ 2.1.3.3, кар->?>амоилфосфат: L-орнитин карбамоилтрансфераза) катализирует шестую стадию синтеза L-аргинина у Е. coli

и репрессируется конечным продуктом этого синтеза. Фермент осуществляет следующую трансферазную реакцию:

Орнитин + Карбамоилфосфат *• Цитру длин + Неорганический

фосфат.

За реакцией следят по появлению производных форм продукта, как описано Нейхардтом и Бойдом {31]. Как и в случае с р-галактозидазой, в качестве источника фермента используют клетки Е. coli, обработанные толуолом, или неочищенные экстракты Е. coli.

К 2 мл обработанных толуолом клеток, разведенных в нужной концентрации, добавляют 0,3 мл 62 мМ кар-бамоилфосфата и 0,3 мл 50 мМ MgCl2. Реакцию запускают добавлением 0,3 мл 0,1 М L-орнитина. Инкубируют 20 мин при 37 °С, затем останавливают реакцию охлаждением во льду и добавлением 2,0 мл 0,25 н. НС1. Смесь хорошо перемешивают и центрифугируют для удаления клеток. Надосадочную фракцию сливают в пробирки. Для определения образовавшегося цитрулли-на отбирают необходимое количество надосадочной фракции (от 0 до 2,0 мл) и обрабатывают следующим образом. Разводят пробы до 2,0 мл дистиллированной водой (контрольная проба содержит только воду) и добавляют специальной пипеткой 1,0 мл смеси серной и фосфорной кислот (1:3) и 0,13 мл 3%-ного 2,3-бутади-онмоноксима. Хорошо перемешивают, закрывают пробирки стеклянными шариками и нагревают в бане с кипящей водой в течение 10 мин. Затем пробы охлаждают 10 мин в закрытой от света холодной водяной бане {свет вызывает побочную реакцию). Измеряют оптическую плотность при 490 нм и находят количество молей образовавшегося цитруллина по калибровочной кривой, полученной для L-цитруллина в диапазоне от 0 до 0,25 мкмолей. За единицу активности фермента принимают такое его количество, при добавлении которого образуется 1 мкмоль цитруллина в 1 мин в указанных условиях.

18.2.8. Гидролазы (р-галактозидаза)

р-Галактозидаза (КФ 3.2.1.23, p-D-галактозид— га-лактогидролаза) катализирует следующую гидролазнуку реакцию:

о-Нитрофенил-Р-О-галактопиранозид (ОНФГ) + Н20 ?

? • >- Галактоза -|- о-Нитрофенол.

Вместо лактозы — естественного субстрата для этого бактериального фермента — можно использовать искусственный субстрат о-нитрофенил-р-О-галактопиранозид (ОНФГ), который не окрашен, но при гидролизе образует о-нитрофенол, имеющий в щелочном растворе желтый цвет. Реакция протекает в присутствии бесклеточного экстракта или клеток, обработанных толуолом; для стимуляции в смесь добавляют ионы Na+ или тиоловые реагенты. Ниже описывается модифицированная методика Парди и др. [34].

Готовят реакционную смесь, содержащую 4,1 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,5, и 0,2 мл 0,032 М восстановленного глутатиона. Смесь выдерживают до установления температуры 30 °С. Добавляют фермент в объеме 0,2 мл и начинают реакцию внесением 0,50 мл 0,01 М ОНФГ (предварительно инкубированного). По окончании инкубации (обычно в течение 15 мин, но вообще это время зависит от количества фермента в клетках) реакцию останавливают. Окраска смеси усиливается, если добавить 1 мл 1 М Na2C03. Смесь встряхивают и измеряют оптическую плотность при 420 нм. За единицу ферментативной активности принимают количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоля о-нитрофенола в 1 ч в условиях эксперимента. Строят калибровочную кривую, отражающую зависимость между оптической плотностью при 420 нм и концентрацией о-нитрофенола в условиях проведения эксперимента.

Клетки, обработанные толуолом, готовят следующим образом. Пробы культуры по 1,0, 0,5 или 0,20 мл добавляют к 4,0, 4,5 или 4,8 мл 0,05 М калий-фосфатного буфера, рН 7,5, для получения разведений 1:5, 1:10 или 1 :25 соответственно. Измерив оптическую плотность этих разведений, по калибровочной кривой можно определить массу (сухой вес) клеток, содержащихся в каждой пробе. Разведения культур можно хранить до анализа на р-галактозидазу в течение 6 ч во льду. Перед самым экспериментом их вынимают из ледяной бани и обрабатывают одной каплей толуола и одной каплей 0,1%-ног

страница 71
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.09.2019)