Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

о дезоксихолата натрия. Закрывают пробирки пробками, встряхивают 15 мин при 37 °С и вновь ставят в ледяную баню. Для определения р-галактозидазной активности (см. выше) из каждой пробы отбирают по 0,2 мл.

18.2.9. Лиазы (треониндегидратаза)

Треониндегидратаза [КФ 4.2.1.16, L-треонин-гидро-лиаза (дезаминирующая)] катализирует следующую реакцию:

L-Треонин а-Кетобутират + NH4+.

У многих бактерий имеются два таких фермента, один из них катализирует деградацию треонина, а другой — синтез. Деградирующий фермент отличается от синтезирующего индуцибельностью, т. е. он способен синтезироваться в отсутствие глюкозы и кислорода в среде, содержащей L-треонин и некоторые другие аминокислоты с разветвленными цепями, однако лучше всего он синтезируется в среде, содержащей более сложную аминокислотную смесь. Деградирующий фермент активируется в присутствии AMP. Синтезирующий фермент репрессируется конечным продуктом; его активность подавляется также L-изолейцином. Активность обоих ферментов измеряют по образованию производного а-кетобутира-та — 2,4-динитрофенилгидразона. Деградирующий фермент исследуют в клеточных экстрактах или в клетках, обработанных толуолом, по следующей методике [20].

В состав реакционой смеси (конечный объем 1 мл) входят 0,20 мл 0,5 М калий-фосфатного буфера (рН7,4), 0,10 мл 0,1 М AMP (нейтрализованного) и 0,20 мл 0,5 М L-треонина. Реакцию начинают при 37 °С добавлением препарата фермента и останавливают внесением 1 мл 1 н. НС1. Затем добавляют 0,2 мл 0,1%-ного 2,4-дини-трофенилгидразина и смесь вновь инкубируют при 37 °С. Приблизительно через 10 мин добавляют 2 мл 2 н.

NaOH и в колориметре измеряют оптическую плотность гидразона при 416 нм. Строят калибровочную кривую, отражающую зависимость между оптической плотностью и концентрацией натриевой соли а-кетобутирата в условиях эксперимента. За единицу фермента принимают такое его количество, которое катализирует образование 1 мкмоля а-кетобутирата в 1 мин в указанных условиях.

Синтезирующий фермент определяют по методике с использованием лизированных клеток или клеточного-экстракта [18]. Ниже приведено описание методики с экстрактами. Реакционная смесь (конечный объем 1,0 мл) состоит из 0,10 мл 1 М трис-HCl, рН 8,0, 0,10 мл 1 М NH4C1, ОД мл 1 мМ пиридоксальфосфата, 0,20 мл 0,2 М L-треонина и 0,10 мл экстракта. Объем смеси до 1,0 мл доводят водой. Для каждой серии анализов готовят контрольную пробу без L-треонина. Пробирки инкубируют при 37°С в течение заранее определенного времени (около 10—20 мин). Останавливают реакцию добавлением 0,10 мл 50%-ной ТХУ и определяют образование а-кетобутирата, как описано выше.

18.2.10. Изомеразы (L-арабинозоизомераза)

L-Арабинозоизомераза (КФ 5.3.1.4, L-арабиноза ке-тол-изомераза) катализирует следующую изомеразную реакцию:

L-Арабиноза »- L-Рибулоза

Этот фермент можно определять в непрерывной системе [48], описанной выше для анализа киназы, в сочетании со следующими сопряженными реакциями:

L -Рибулозокиназа

L-Рибулоза + АТР >- L-Рибулозо-б-Ф -f ADP;

Пируваткиназа

Фосфоенолпируват -f- ADP >- Пируват + АТР;

Л акт а тдегидро геназа

Пируват + NADH >? Лактат -J- NAD.

L-Арабинозоизомеразу можно также исследовать с помощью простого спектрофотометрического метода, основанного на определении образовавшейся кетопентозьз с помощью реакции Дише и Боренфройнда на цистеинкарбазол с использованием L-арабинозы в качестве субстрата [41]. Эту реакцию можно проводить с неочищенными клеточными экстрактами или с клетками, обработанными толуолом, так же как в случае с р-галактози-дазой.

Реакционная смесь (1,0 мл) состоит из 10 мкмолей L-арабинозы, 43 мкмолей трис-буфера, рН 7,5, и препарата фермента в нужном разведении (экстракт или клетки, обработанные толуолом). Для каждой серии анализов готовят контрольные смеси без фермента. После 10 мин инкубации при комнатной температуре (или 30 °С) добавляют 0,20 мл 1,5%-ного раствора цистеингидрохлорида и б мл смеси, приготовленной из 190 мл воды и 450 мл конц. H2S04. Сразу же после этого добавляют 0,2 мл 0,12%-ного спиртового раствора карба-зола. Смесь встряхивают и оставляют на 20 мин при комнатной температуре. Измеряют оптическую плотность при 540 нм в колориметре или спектрофотометре. За единицу активности принимают количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоля L-рибуло-зы в 1 мин в указанных условиях. Для построения калибровочной кривой (в пределах 0—0,25 мкмоля), отражающей зависимость между оптической плотностью при 540 нм и концентрацией L-рибулозы в данных условиях, используют имеющийся в продаже L-рибулозо-о-нитро-фенилгидразон.

18.2.11. Лигазы (глутаминсинтетаза)

Глутаминсинтетаза [КФ 6.3.1.2, L-глутамат: аммиак лигаза (образующая ADP)] участвует в первом этапе сильно разветвленного пути, ведущего к биосинтезу многих важных конечных продуктов. У Е. coli и Klebsiella aerogenes этот строго регулируемый фермент подвержен: 1) репрессии/дерепрессии, 2) сложному ингибиро-ванию по типу обратной связи и другим аллостеричес-ким изменениям, а также 3) ковалентной модификации. Глутаминсинтетаза катализирует следующую реакцию:

Глутамат -f- NH3 -f- АТР > Гдутамат -j- ADP -f Неорганический

фосфат.

Ее активность можно определять несколькими различными способами [40], в том числе с помощью описанной :выше для киназ сопряженной реакции, заключающейся в окислении NADH+:

Глутамат -f NADH+ -f NH3+ -f Фосфоенол пиру ват

Пируваткиназа Л акт атде гидрогена за \ Глутаминсинтетаза

Глутамин NAD -j- Лактат -f- Неорганический фосфат.

СХотя в реакционную смесь добавляют АТР и в результате глутаминсинтетазной реакции образуется ADP, в суммарном уравнении эти два вещества не фигурируют.

При такой постановке эксперимента непрерывная регистрация каталитической активности достигается благодаря сопряжению образования ADP, катализируемого глутаминсинтетазой, и окисления NADH-1-, катализируемого пируваткиназой и лактатдегидрогеназой в присутствии фосфоенолпирувата (последние три компонента добавляют в избытке). Этот удобный, чувствительный и прямой метод, позволяющий осуществлять различные акинетические измерения, не пригоден, однако, для анализа ингибирования по типу обратной связи, так как на активность ферментов могут также влиять различные эффекторы.

При изучении регуляции (путем аденилирования/де-аденилирования) глутаминсинтетазной активности с помощью ковалентной модификации очень удобен транс-«феразный тест, включающий реакцию

АДФ, Арсен ат

Глутамин-j-Гидроксиламин< у-ГлУтамиЛгИДР0КсамаТ4-^Н4 .

По этой реакции определяют общее количество присутствующей глутаминсинтетазы, так как и аденилирован-ная и деаденилированная ее формы активны. Кроме того, можно использовать целые клетки, сделав их проницаемыми для реагентов путем обработки бромидом гек-садецилтриметиламмония. Определение активности глутаминсинтетазы у Е. coli подробно описано Штадтманом и др. [45], а у Klebsiella aerogenes — Бендером и др. [3]. Ниже приведена методика из второго источника [3], представляющая собой вариант методики Шапиро и Штадтмана [40].

Реакционную смесь готовят ежедневно из указанных объемов основных растворов (в скобках даны конечные концентрации каждого компонента: 7,53 мл воды; 2,25 мл 1 М имидазола-HCl, рН 7,15 (135 мМ); 0,37 мл 0,80 М гидроксиламингидрохлорида (18 мМ); 0,045 мл 0,1 М МпСЬ (0,27 мМ); 1,5 мл 0,28 М арсената калия, рН 7,15 (25 мМ); 0,15 мл 40 мМ Na-ADP, рН 7 (0,36 мМ); 1,5 мл бромида гексадецилтриметиламмония с концентрацией 1 мг/мл (90 мкг/мл). Если в опыте используют неочищенный экстракт клеток или очищенный фермент, последний раствор заменяют водой.

Доводят рН этой концентрированной смеси до 7,55 с помощью 2 М КОН при комнатной температуре и охлаждают до 4°С,если опыт начинают не сразу. К 0,40 мл этой смеси добавляют фермент и доводят объем до 0,45 мл водой. Выдерживают 5 мин при 37 °С для выравнивания температуры и начинают реакцию добавлением 0,05 мл 0,2 М L-глутамина. После инкубации в течение необходимого времени реакцию останавливают добавлением 1 мл «стоп-смеси». В состав этой смеси входит FeCl3-6H20 (55г), ТХУ (20г),конц. НС1 (21мл) и вода (до 1 л). Пробы центрифугируют для удаления осадка и измеряют оптическую плотность при 540 нм. В этих условиях 1 мкмоль глутамилгидроксамата при 540 нм имеет оптическую плотность 0,532. За единицу активности принимают количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоля глутамилгидроксамата в 1 мин, а удельную активность находят, поделив активность фермента на количество клеточного белка в миллиграммах. Для каждой серии опытов готовят контрольные пробы, содержащие вместо растворов арсената и ADP воду. Это позволяет сделать поправку на 7-глут-амилгидроксамат, образующийся благодаря возможному присутствию любой глутаминазы. При таком определении и аденилированная и неаденилированная формы фермента активны. Для определения активности только неаденилированного фермента к реакционной смеси добавляют 60 мМ MgCl2 при рН 7,15.

Штадтман и сотр. [40, 45] вычислили значение п (состояние аденилирования) для этого фермента у Е. coli в условиях, сходных с описанными выше:

~ Активность в 0,4 М МпС12 + 60 мМ MgCl2, рН 7,2

rt — 12 — 12 Активность в 0,4 М МпС13, рН 7,38

18.3. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ 18.3.1. Общие замечания

После точного, чувствительного и стандартизированного определения активности фермента можно переходить к выяснению вопроса о том, подвергается ли фермент одному или нескольким процессам регуляции метаболизма. Показано, что у бактерий существуют два основных типа регуляции ферментативной активности — аллостерический и ковалентная модификация.

Виды аллостерической регуляции ферментативной активности:

Простое ингибирование конечным продуктом Кумулятивное ингибирование конечным продуктом Последовательное ингибирование конечным продуктом

Стимуляция предшественником

Ингибирование предшественником

Стимуляция продуктом

Ингибирование продуктом

Регуляция с помощью энергетического заряда

Катаболитное ингибирование

Виды регуляции с помощью ковалентной модификации ферменто

страница 72
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.09.2019)