Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

отсутствие 60 мМ MgCb, как указано в методике, для того чтобы установить степень ковалентной модификации в результате аммиачного «шока». Известно, что и у Е. coli, и у К. aerogenes присутствие NH4+ способствует аденилированию глутаминсинтетазы [3, 40, 45].

18.4. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА 18.4.1. Общие замечания

Перефразировав изречение дельфийского оракула «Познай самого себя», можно посоветовать каждому, кому предстоит выбрать вид или штамм бактерии для изучения конкретного аспекта метаболизма: «Познай свою бактерию».

В наш век специализации стал обычным тот факт, что многие бактериологи посвящают годы, а то и всю свою научную судьбу изучению одного вида микроорганизма. Во многих случаях это оправданно. Но вместе с тем бывают ситуации, когда следует воспользоваться бесконечным разнообразием мира микробов и выбрать объект, более отвечающий целям конкретного исследования. Иногда таким объектом может оказаться малознакомый представитель микроорганизмов. Поэтому время от времени полезно изучать не только широкоизвестные, но и малоизвестные виды.

Приступая к изучению биосинтеза аминокислот, никто не станет, например, продолжать работать с молочнокислыми бактериями. Эти организмы плохо синтезируют аминокислоты, поэтому последние приходится добавлять в их ростовую среду. По-видимому, гораздо более подходящей для этой цели является такая бактерия, как Е. coli, которая синтезирует все свои аминокислоты из глюкозы и NH4+. Однако для изучения регуляции биоэнергетических процессов у бактерии, не связанных с участием кислорода, более пригодными могут оказаться молочнокислые бактерии, а не Е. coli. В любом случае пригодность микроорганизма для конкретного исследования определяется в основном его генетическими возможностями. Иногда можно изменить генетический потенциал в соответствии с исследовательской задачей. Это делают путем получения и отбора подходящих мутантных штаммов. Отбор таких мутантов — чрезвычайно важная процедура, ставшая одним из основных элементов методического багажа бактериолога —? уже обсуждался в гл. 13 данного руководства.

Даже если генетические возможности микроорганизма позволяют ему продуцировать определенный фермент, при этом еще не гарантируется его синтез (транскрипция и трансляция). Синтез многих ферментов и ферментных систем зависит от присутствия или отсутствия определенных регуляторных компонентов, или «триггеров», образующихся эндогенно или вносимых в культу-ральную среду. Вещества, стимулирующие транскрипцию, называют индукторами, а сам процесс стимуляции называют индукцией. В тех случаях, когда индукторов нет, говорят о деиндукции. Другие вещества, называемые репрессорами, напротив, предотвращают транскрипцию, а сам процесс предотвращения транскрипции называют репрессией; в отсутствие репрессора происходит дерепрессия. Описаны различные типы репрессии у бактерий: простая репрессия по типу обратной связи, или репрессия конечным продуктом; мультивалентная репрессия, присущая определенным ферментам, участвующим в синтезе аминокислот с разветвленной цепью; координированная репрессия, когда все ферменты, участвующие в биосинтезе, согласованно репрессируются в присутствии высоких концентраций продукта реакции (например, триптофана или гистидина). Описанные ни-же эксперименты иллюстрируют некоторые типы регуляции синтеза бактериальных ферментов путем индукции и репрессии.

18,4.2. Индукция (нитратредуктаза)

Используя соответствующий дикий штамм Е. coli (например, ML 30 или К-12) и описанный ранее нитрат-редуктазный тест (разд. 18.2.4), можно продемонстрировать индукцию нитратредуктазы. Для этого к среде добавляют NO3- и выращивают культуру в анаэробных условиях. Можно также измерить накопление и последующую утилизацию N02~ в культуральной среде. Эти два процесса служат индикаторами регуляции активности нитрат-(или нитрит-)редуктазной системы.

Свежую культуру после одной ночи выращивания высевают в несколько колб с основной средой, содержащей (на 1 л): 2 г КН2Р04, 7 г К2НР04) 1 г (NH4)2S04 и 0,1 г MgS04-6H20, рН 7,2. Непосредственно перед инокуляцией добавляют в нее стерильный раствор, содержащий 0,02 М глюкозу и 0,25% (конечная концентрация) безвитаминного гидролизата казеина. Культуру выращивают при сильном встряхивании до получения приблизительно 50 мкг клеток (сухого веса) на 1 мл среды или дольше (до видимого помутнения среды) и затем обрабатывают следующим образом.

Культура А: добавляют 20 мМ NaN03 и поддерживают в аэробных условиях.

Культура Б: добавляют 20 мМ NaN03 и создают анаэробные условия, поместив культуру в плотно закрывающийся сосуд и пропуская через нее N2 или смесь N2—С02 (95 и 5% соответственно).

Культура В: NaN03 не добавляют, но создают анаэробные условия, как описано выше.

Культура Г: добавляют 20 мМ NaN03, поддерживают в аэробных условиях в течение нескольких часов, затем создают анаэробные условия (как для культуры Б). Если необходимо, культуру вновь переводят в аэробные условия спустя несколько часов.

Подобный эксперимент можно разработать и осуществить при изучении регуляции деградирующей трео-пиндегидратазы. Подобно нитратредуктазе, этот фермент синтезируется только в анаэробных условиях и репрессируется сАМР и катаболитами.

В обоих случаях отбирают пробы культуры (если мутность настолько высока, что мешает последующему анализу, пробы центрифугируют) и определяют образование N02"~ по следующей методике. Пробы из каждой культуры (0,2 мл) добавляют к 1 мл реактива А, содержащего 0,80% сульфаниловой кислоты в 5 н. уксусной кислоте. Пробы разбавляют до 10 мл 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,5, затем добавляют 1,0 мл реактива Б (6 мл диметил-а-нафтиламина в 1 л 5 н. уксусной кислоты). Оставляют на 30 мин для развития окраски, измеряют оптическую плотность при 540 нм и вычисляют концентрацию N02"~ в каждой пробе по ранее полученной калибровочной кривой.

Можно также отбирать пробы культур и после центрифугирования измерять активность нитратредуктазы в клетках, как описано выше (разд. 18.2.4). Этот фермент синтезируется только в анаэробных условиях и требует в качестве индуктора N03~ (удаление ЫОз~ приводит к деиндукции).

18.4.3. Репрессия конечным продуктом реакции (орнитин — карбамоилтрансфераза)

Этот важный регуляторный процесс легко демонстрируется на большинстве штаммов Е. coli при сравнении культур, выращенных на основной среде, содержащей глюкозу и минеральные соли, в присутствии L-ap-гинина и без него [31]. Орнитин — карбамоилтрансфераза катализирует шестую, заключительную, стадию синтеза конечного продукта—L-аргинина. В присутствии L-ap-гинина синтез фермента репрессируется. Это можно показать при выращивании дикого штамма в течение ночи в любой подходящей солевой среде (например, как описано в других разделах этой главы), содержащей для культуры 1 :0,02 М раствор глюкозы; для культуры 2:0,02 М раствор глюкозы и L-аргинин (100 мкг/мл); для культуры 3:0,02 М раствор глюкозы и другую аминокислоту, например гистидин (100 мкг/мл).

Клетки собирают, промывают 0,1 М трис-НС1-буфе-ром, рН 7,8, и определяют орнитин — карбамоилтранс-феразу, как описано выше.

18.4.4. Мультивалентная репрессия (L-треониндегидратаза)

С помощью подобной же серии опытов можно продемонстрировать чувствительность L-треониндегидратазы (синтезирующего фермента) к мультивалентной репрессии конечным продуктом реакции (L-изолейцином, I-лейцином, L-валином). Для такой репрессии требуется присутствие всех трех аминокислот (Умбэргер, личное сообщение).

Культура 1 :200 мл минимальной среды и 0,02 М глюкоза.

Культура 2: 200 мл минимальной среды, 0,02 М глюкоза, 0,8 мМ L-валин, 0,4 мМ L-лейцин и 0,4 мМ L-изо-лейцин.

Культура 3: 200 мл минимальной среды, 0,02 М глюкоза, 0,8 мМ L-валин, 0,4 мМ L-лейцин и 0,15 мМ L-изо-лейцин.

С помощью описанного выше теста на треониндегид-ратазу измеряют удельную активность фермента в клетках, выращенных в течение ночи в трех описанных выше средах. В культуре 2 должна выявляться более низкая ферментативная активность, чем в культуре 1. Культура 3 будет подвергаться дерепрессии относительно культуры 2 из-за постепенного снижения внутриклеточной концентрации L-изолейцина (содержание L-изолей-цина в культуре 3 понижено с самого начала, и, кроме того, его поглощение ингибируется двумя другими аминокислотами) .

Опубликован прекрасный полный обзор общих методов, применяющихся для определения активности ферментов и путей регуляции их биосинтеза [5].

18.4.5. Индукция плюс репрессия (/ас-оперон)

При функционировании /ас-оперона Е. coli происходит как репрессивная (отрицательная), так и индуктивная (положительная) генетическая регуляция (рис. 18.6). Присоединение /ас-репрессора (продукта гена i) к сайту оператора предотвращает транскрипцию генов, катализируемую РНК-полимеразой (отрицательная регуляция). Индуцирующий агент (любой из р-галактозидов)

РЕЕУЛЯТОРИЫЙ БЕЛОК &И.-ОПЕРОНА~

Р~Галактозидные эсрсректоры (например, IPTG)

О

ОПЕРОН

[с AMP- СРР J ^-ГАЛАКТОЗИДАЗА

САМР + РР, k

АДЕНИЛАТЦИКЛАЗА АТР

алактозид-пермеаза

jS-rалактозид-трансацетилоза

Рис. 18.6. Положительная и отрицательная регуляция /ас-оперона у Е. coll. Компоненты, участвующие в транскрипции /ас-оперона, включают; гены Z, У и А, кодирующие р-галактозидазу, р-галактозидпер-меазу и [3-галактозидтрансацетилазу соответственно; регулятор-ный ген кодирующий образование регуляторного белка tac-оперона; промотор (Р) и оператор (О); а также гены СУА и СГР, кодирующие синтез аденилатциклазы, и белок, связывающий cAMP (CRP), соответственно. IPTG — изопропил-р-ГЗ-тиогалактопиранозид.

модифицирует белок-репрессор таким образом, что он теряет способность связываться с оператором. Однако одного этого недостаточно для инициации процесса транскрипции. Чтобы РНК-полимераза смогла осуществлять свою каталитическую функцию в транскрипции, необходимо присутствие положительного регуляторного элемента — белка — рецептора сАМР (продукта сгр-ло-куса). Такой модифицированный благодаря связыванию сАМР белок присоединяется к промотору. В результате включается /ас-оперон и начинается транс

страница 74
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2019)