Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

помощью трехходового крана, !4С02 можно отбирать во время опыта через определенные интервалы и использовать его в кинетических исследованиях, в частности, как описано Уонгом [47] для анализа путей метаболизма с помощью радиореспи-рометрии.

Клетки активно растущей культуры Е. coli собирают, промывают и ресуспендируют в свежей основной солевой среде (разд. 18.4.2), содержащей NH4+, NH4+ и гидролизат казеина или любой другой источник азота. Для таких быстро растущих культур, как Е. coli, в начале эксперимента достаточно 50—100 мкг (сухой вес) клеток на 1 мл среды, для более медленно растущих организмов требуется большая биомасса. Раствор 14С-глю-козы (равномерно меченной с удельной активностью 105 имп/мин-мкмоль или выше) помещают в боковой отвод и вливают в сосуд с культурой (конечная концентрация 10 мМ), начиная тем самым эксперимент. Открывают систему газонаполнения, культуру встряхивают (можно поместить все устройство на лабораторную качалку с термостатируемой водяной баней) и начинают отбор газа в ловушки. 14С02 собирают с помощью газоулавливающего раствора — смеси моноэта-ноламина и абсолютного этанола (1:2; 10 мл). Газоулавливающий раствор сливают с 20—30-мин интервалами из колонок, для изготовления которых достаточно иметь стеклянные хроматографические колонки с вплавленным в основание пористым стеклянным фильтром, снабженные отверстиями для ввода газа, как показано на рис. 18.10, и разбавляют абсолютным этанолом до 20 мл. Затем отбирают пробы и определяют радиоактивность (внеся соответствующие поправки на тушение) с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика (разд. 16.4.3). Таким образом, подсчитывают общее количество 14С02, образующегося в результате метаболизма глюкозы.

После 2—3 ч роста в культуру вливают H2S04 для остановки реакции и высвобождения растворенного 14С02. Пропускание газа продолжают в течение 15 мин, затем устройство демонтируют. После этого культуру обрабатывают описанным ниже способом.

Определение неиспользованного субстрата

Концентрацию глюкозы в начале и в конце периода роста культуры определяют с помощью любой стандартной методики. Разность этих величин равна количеству глюкозы, потребленной клетками. Поскольку удельная радиоактивность глюкозы известна, можно вычислить процент суммарной активности культуры в минуту, приходящейся на неиспользованную глюкозу. Следовательно, остальная радиоактивность приходится на С02, негазообразные конечные продукты и углерод, ассимилированный клетками.

Определение ассимилированного 14С

Готовят различные разведения выше указанной культуры, фильтруют их через мембранные фильтры (с размером пор 0,45 мкм), промывают и затем измеряют общую радиоактивность, которая соответствует радиоактивному углероду, включенному в клетки.

Можно также отобрать пробу шприцем до остановки роста культуры путем добавления H2S04, отцентрифуги-ровать ее, промыть свежей средой и вновь отцентрифу-гировать. После этого осажденные клетки можно фракционировать для выявления распределения 14С между клеточными компонентами с помощью методики, описанной Робертсом и др. ([38]. Эта методика полезна при проведении многих исследований. Разработаны также ее модификации, которые в некоторых случаях могут быть более подходящими (разд. 17.1). Осадок клеток сначала суспендируют в 5 мл 5%-ной ТХУ и выдерживают 30 мин в ледяной бане. Отбирают аликвоты суспензии и определяют общую радиоактивность клеток. Затем суспензию центрифугируют и отделяют надосадочную фракцию.

Измеряют радиоактивность этой фракции, которая растворима в холодной ТХУ, содержащей низкомолекулярные вещества. Осадок ресуспендируют в 5 мл 75%-ного этанола, нагревают при 45 °С в течение 30 мин и затем центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают и отбирают из нее аликвоту для измерения радиоактивности, присутствующей в спирторастворимой фракции. Осадок ресуспендируют в 5 мл 7,5%-ной смеси этанола и диэтилового эфира (1:1), нагревают при 45°С в течение 30 мин и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают и определяют радиоактивность фракции, растворимой в смеси спирта и эфира. Эти две фракции содержат суммарные клеточные липиды и некоторые спирторастворимые белки. Осадок ресуспендируют в 5%-ной ТХУ, помещают в кипящую водяную баню на 30 мин и вновь центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают и отбирают пробу этой фракции, растворимой в ТХУ (фракции нуклеиновых кислот), для определения радиоактивности. Осадочную фракцию, нерастворимую в горячей ТХУ (белки и клеточные стенки), ресуспендируют в 0,01 н. NaOH и измеряют в ней радиоактивность. С помощью этой методики определяют не только долю общей радиоактивности субстрата, ассимилированную клетками, но и устанавливают природу тех макромолекул, в которые включился изотоп.

Определение негазообразных конечных продуктов (см. также разд. 16.3.1 и 16.3.4)

Перед окончанием роста культуры отбирают 5 мл пробы (или больше) и добавляют к 5 мл смеси немеченых соединений, содержащей достаточное количество H2SO4, так чтобы конечный рН был равен 1,5—1,8. При этом происходит остановка реакции и перевод всех присутствующих в среде метаболитов в кислотную форму. Смесь немеченых соединений (при использовании Е. со-И) содержит следующие компоненты, растворенные в основной ростовой среде: этанол, уксусную кислоту, пиро-виноградную кислоту, муравьиную кислоту, фумаровую кислоту, молочную кислоту, янтарную кислоту и лимонную кислоту. Ввиду малых количеств конечных продуктов в 5—10 мл культуральной среды использование смеси немеченых соединений существенно для получения количественного выхода радиоактивных конечных продуктов, образуемых клетками. Концентрация каждого компонента смеси равна 0,1 М, за исключением фумаро-вой кислоты, концентрация которой составляет 0,05 М. Смесь немеченых соединений вместе с культурой центрифугируют для удаления клеток. Надосадочную жидкость отделяют и хранят до анализа в замороженном состоянии. При исследовании разных организмов требуется приготовление смесей различных немеченых соединений. Их состав, естественно, зависит от природы конечных продуктов, которые должны накапливаться в культуральной жидкости.

Негазообразные конечные продукты, присутствующие в 1 мл такой пробы, определяют с помощью хроматографии на кремневой кислоте следующим образом. 1 мл пробы смешивают с 1,8 г сухой кремневой кислоты (хро-матографической степени чистоты), смесь вносят в верхнюю часть колонки с 5 мл бензола. Для набивки колонки смешивают 10 г кремневой кислоты с 6,5 мл 0,5 н. H2S04 до сыпучего состояния. Добавляют бензол для получения суспензии, которую вливают в колонку, а затем ее промывают бензолом. Колонку набивают под давлением 0,9 кг/м2, следя за тем, чтобы материал насадки не подсыхал и не отделялся от стенок колонки. (Осторожно] Бензол обладает слабым канцерогенным действием.)

Через колонку пропускают 50 мл хлороформа, а затем 600 мл градиентной смеси, которую готовят следующим образом. В смеситель наливают 300 мл хлороформа, а в резервуар 300 мл 5%-ного раствора грег-бута-нола в хлороформе. После окончания элюирования добавляют еще 50 мл 5%-ного грег-бутанола в хлороформе, а затем 100 мл 10%-ного трет-бута-нола в хлороформе. Все растворители пропускают через колонку со скоростью 2 мл/мин с помощью насоса. Предварительно их обрабатывают 20 мл 0,5 н. H2SO4 (на 1 л растворителя) в делительной воронке, затем «высушивают», фильтруя через два слоя сухой фильтровальной бумаги (не допуская, чтобы водный слой проходил через фильтр).

Фракции по 10 мл собирают с помощью сифона и автоматического коллектора фракций. Из каждой фракции отбирают определенный объем и вносят в флаконы для сцинтилляционного счетчика. Радиоактивность измеряют в соответствующих смесях или жидкостях. Необходимо помнить о поправке на тушение сцинтилляции (за счет хлороформа), которое может иметь место (разд. 16.4.3). Пробы с известным содержанием 14С-эта-нола, -ацетата, -пирувата, -формиата, -лактата и -сук-цината обрабатывают, как описано выше, для определения последовательности их элюирования и процента выхода. Во всех случаях выход составляет в основном

Если это не соблюдается, то возможна какая-либо экспериментальная ошибка.

Общая радиоактивность, присутствующая в культуре в конце периода роста, равна сумме всех этих радиоактивностей, за исключением радиоактивности углерода в газообразных продуктах (RHCx—G или SH+A+E). Если все клетки удаляют центрифугированием в конце периода роста, то общая радиоактивность надосадочной фракции представляет собой лишь сумму радиоактивностей неиспользованного субстрата (SH) и негазообразных конечных продуктов (Е). Величина Е равна сумме всех веществ, элюированных из колонки с кремневой кислотой. Если это не так, то не исключено, что в растворе присутствует конечный продукт, не обнаруживаемый в указанных условиях.

Установив балансовые взаимоотношения и определив путь превращений углерода, можно сделать некоторые общие заключения, касающиеся биоэнергетических и биосинтетических путей метаболизма. Например, появление радиоактивности в клеточной фракции, не растворимой в горячей ТХУ, означает участие меченого субстрата в биосинтезе аминокислот или реакциях биосинтеза клеточных стенок. Природа образующихся газообразных и негазообразных конечных продуктов и их соотношение могут служить ключом к определению типов биоэнергетических путей, используемых в условиях роста, применявшихся в эксперименте. Проводя подобные исследования в изменяющихся условиях роста бактерий (в аэробных и анаэробных, на богатой и бедной среде, в присутствии и в отсутствие различных ингибиторов и т. д.), можно получить дополнительные сведения в этом отношении.

18.5.3. Наличие ключевых ферментов

Другой необходимый этап работы, направленный на выявление какого-либо пути метаболизма, заключается в определении тех ферментов, которые отличают один путь от другого, т. е. являются ключевыми ферментами того или иного пути метаболизма. Разработаны методики определения ключевых ферментов, участвующих во многих классических путях диссимиляции углеводов,

Таблица 18.3, Ключевые ферме

страница 77
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.09.2019)