Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

слоты [13]. Но эти методы не специфичны в отношении декстрана, и определению могут мешать другие вещества, специально добавленные в среду или перешедшие в нее из клеток. Было бы удобно использовать декстраны с радиоактивной меткой, но средняя молекулярная масса самых крупных из коммерчески доступных меченых дек-странов (например, поставляемых фирмой New England Nuclear Corp.) составляет всего лишь около 70 000. Самые мелкие молекулы этого препарата могут проходить через клеточные стенки некоторых бактерий, хотя и не всех. Поэтому в одних случаях этот препарат пригоден, а в других нет, и, прежде чем использовать его в опытах с определенными клетками, нужно определить порог их проницаемости. Конечно, можно метить более крупные молекулы декстрана 14С-цианидом с помощью обычных методов получения карбоксил-декстрана. Для колориметрических анализов использовали синие декстраны (Pharmacia), но клетки бактерий могут окраситься при контакте с синим декстраном вследствие переноса красителя.

Вместо декстранов можно использовать некоторые другие полимерные молекулы. Белки (например, сывороточный альбумин) имеют то преимущество, что они в основном монодисперсны и поддаются специфическому анализу. Недостаток же их в том, что они могут связываться с клетками, и это приводило бы к получению завышенных величин поглощения. Использовали также инсулин, но он способен проникать через клеточные стенки многих бактерий, особенно грамположительных [41].

Еще одна трудность при определении межклеточного объема связана с набуханием и сжатием бактериальных клеток под воздействием многих растворов, особенно растворов солей. Иногда бывает необходимо определить межклеточный объем в присутствии такого растворенного вещества и декстрана. Если молекулы этого растворенного вещества невелики (например, в случае NaCl или КС1), можно диализовать надосадочную жидкость, удерживая крупные молекулы декстрана в диализном мешке и постепенно удаляя малые молекулы растворенного вещества; тогда в диализном мешке окажется весь декстран, необходимый для анализа.

19.1.3. Выражение результатов

Наиболее распространенный, по крайней мере в бактериологии, показатель проницаемости — это величина занимаемого пространства S, которую можно вычислить по формуле

где Уз — объем раствора, добавленного к осадку, V?— объем осадка (часто вместо этой величины используют Wp — вес влажного осадка), С0 — начальная концентрация растворенного вещества и С\ — его конечная концентрация. Значения S отражают долю объема клеточного осадка, в которую проникает растворенное вещество.

Однако нас интересует доля действительного объема самих клеток, а не осадка, т. е. значение R. Его вычисляют по формуле

где 5Soi — объем, занимаемый исследуемым растворенным веществом, a Sdex— объем «декстранового», или межклеточного, пространства. Нулевая величина R означает, что клетки непроницаемы для растворенного вещества. Величины R от 0 до 1 означают различную степень проницаемости. R>1 означает, что растворенное вещество концентрируется в клетках.

При использовании веса осадка как меры его объема обозначения S и R часто сопровождают индексом w. Кроме того, часто желательно бывает отнести полученный результат к единице веса клеток или объема клеточной воды, например указать клеточный объем, проницаемый для сахарозы, на 1 г сухого веса клеток или на 1 мл клеточной воды.

19.1.4. Определение объема клеток

Из найденных значений занимаемого объема (S) можно извлечь полезную цитологическую информацию, например получить наиболее точные данные о средней величине клеток той или иной бактерии. Разность между объемом осадка и межклеточным объемом равна объему клеток. Если осадок ресуспендировать в воде до определенного объема (скажем, 50 мл) в мерной колбе, то можно определить число клеток с помощью камеры Петрова — Хауссера, а затем вычислить средний объем клетки. Этот метод можно также использовать для определения объема протопласта в клетке (разд. 19.3.2).

19.1.5. Определение содержания воды в клетке (см. также разд. 25.2)

Ресуспендированные клетки можно также использовать для определения их сухого веса, что позволяет вычислить сухой вес отдельной клетки. Количество клеточной воды равно разности между сырым и сухим весом клетки. Поскольку вес или объем межклеточной воды известен, можно определить количество клеточной воды по количеству воды в осадке.

Иногда удобно определять содержание воды в клетках непосредственно по значению R для таких растворенных веществ, как 2Н2, 14С-мочевина или 14С-глицерин, которые легко проникают в покоящиеся клетки, но не концентрируются в них. Иногда для определения количества клеточной воды используют и воду, меченную тритием, но необходимо помнить, что тритий может быстро обмениваться на обычный водород различных клеточных полимеров и мономеров, особенно содержащих ионизируемые компоненты.

19.1.6. Общие замечания

Основные достоинства объемного метода — простота и надежность. Однако он не совсем пригоден для кинетических измерений, так как довольно много времени уходит на смешивание клеток с испытуемым раствором и их последующее разделение. Таким образом, этот способ хорош для определения равновесных условий, но не для измерения скорости процессов. При использовании очень концентрированных суспензий обычно не возникает трудностей, связанных с избыточным выщелачиванием из клеток физиологически важных растворенных веществ (например, ионов калия). Однако густота суспензии затрудняет контроль рН или достаточную аэрацию аэробных культур. Таким образом, этот способ наиболее полезен при изучении покоящихся клеток и менее пригоден в случае активно метаболизирующих бактерий. Как уже упоминалось, может стать проблемой получение большой клеточной массы. Между тем точность метода зависит от наличия больших количеств клеток — в основном потому, что поглощение растворенного вещества определяется по изменению его концентрации в суспендирующей среде.

19.2. ТРАНСПОРТ 19.2.1. Методика анализа

1. Подготовка клеток

Для изучения скоростей транспорта растворенных веществ нужно иметь возможность быстро отделять клетки от среды, в которой они суспендированы. Обычно это делают путем фильтрации через мембранные фильтры, поэтому лучше использовать разбавленные суспензии. Для фильтрации проб объемом 1 мл через фильтр диаметром 25 мм обычно приходится готовить клеточную суспензию, содержащую менее 200 мкг сухого вещества в 1 мл.

Как и при определении проницаемости, при изучении транспорта необходимо уделять большое внимание контролю условий выращивания и сбора клеток. При исследовании процессов транспорта очень важен выбор сред для отмывания и суспендирования, так как клетки в разбавленных суспензиях более чувствительны к неблагоприятным факторам, чем в густых взвесях, где содержатся большие количества веществ, выделяемых самими клетками.

При изучении транспортных процессов может потребоваться предварительная обработка клеток; например, используют голодание, чтобы истощить эндогенные пулы аминокислот. Голодание может быть особенно полезным при добавлении в среду веществ с радиоактивной меткой, так как оно уменьшает изменения удельной активности в результате разбавления внутриклеточными немечеными веществами. Однако голодание может привести и к исчерпанию в клетках аденозинтрифосфата или фосфоенолпирувата или же к снижению протоно-движущей силы. Поэтому может потребоваться внесение (наряду с испытуемым растворенным веществом) какого-либо субстрата для поддержания транспортных процессов.

2. Смешивание клеток с раствором и инкубирование

Клеточную суспензию и раствор испытуемого вещества доводят отдельно до температуры, выбранной для эксперимента, а затем смешивают, отмечая этот момент как нулевое время. Обычно смешивать надо быстро, так как большинство транспортных процессов протекает с высокой скоростью. Реакционную смесь инкубируют, как правило, недолго (например, 10 мин).

3. Отбор проб и разделение

Пробы реакционной смеси отбирают через короткие интервалы времени (например, 1 мин). Клетки и испытуемый раствор быстро разделяют, обычно путем фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, предварительно смоченный промывным или испытуемым раствором. Можно использовать фильтры и с меньшим размером пор, но они оказывают большее сопротивление потоку жидкости и замедляют процесс фильтрации. Фильтры с размером пор 0,45 мкм пригодны для отделения большинства микробных клеток. Обычно используют ацетатцеллюлозные и нитратцеллю-лозные фильтры, особенно если планируется сцинтилля-ционный счет радиоактивности. Вакуум в приемной колбе создается с помощью лабораторной вакуумной линии или, если этого недостаточно, с помощью вакуумного насоса. Используемую обычно в воронках для фильтрования насадку с зажимом можно заменить изготовленным на заказ тяжелым латунным кольцом для удерживания диска фильтра. Кольцо можно быстро устанавливать и снимать, что позволяет повторно использовать одну и ту же фильтровальную установку. Можно также приобрести или изготовить установку для одновременного фильтрования через ряд независимых фильтров, дающую возможность очень быстро отбирать пробы.

Иногда удобно смешивать компоненты в шприце с приставкой для фильтрования Swinney, с помощью которой можно выдавливать пробы среды, освобожденной от клеток. Недостаток этого метода состоит в том, что для оценки поглощения приходится определять разности концентраций растворенных веществ в суспендирующей среде. Кроме того, отбор приводит к постепенному повышению концентрации в оставшейся части смеси.

В некоторых случаях можно отделять клетки центрифугированием, даже если требуются кинетические данные. Мини-центрифуги с маленькими пробирками объемом 250—1500 мкл могут за несколько секунд набирать скорость, соответствующую 12 000 g. Левин и Фриз [25] описали метод оценки поглощения растворенных веществ клетками Bacillus subtilis с помощью так называемой мини-фуги.

Кроме того, часто можно останавливать транспортные реакции, помещая пробы в лед или в охлажденный до температуры льда буфер. По

страница 80
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(09.12.2019)