Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

рН0 - log[Aj]/[HAe] - log[Ae]/[HA0] = - log[A|]/[HAi] +Iog[HA0]/[A0] = = log{[Ai]/[HAilX[HA0]/[A0]},

ApH^loglAjMAJ.

Значение ДрН можно, таким образом, оценить по распределению, например, ацетата между клетками и суспендирующей средой с помощью описанной выше методики анализа проницаемости. Из наружной концентрации ацетата и рН можно вычислить наружную концентрацию НА, равную внутренней. Внутренняя концентрация А равна разности между общей внутренней концентрацией ацетата и концентрацией НА. Зная соотношение {А»]/[НА*] и значение рЮ» можно найти внутриклеточный рН с помощью уравнения Гендерсо-на—Хассельбаха.

Метод занимаемого объема позволяет также определить поглощение веществ — индикаторов рН. Кроме того, можно применять методы, не требующие больших количеств клеток, если для определения нецитоплазма-тической воды используется какое-нибудь не проникающее в клетку соединение. Например, в статье Мэлони и др. [3] на стр. 29 приводится пример определения неци-топлазматической воды в суспензии клеток Streptococcus lactis с помощью 3Н-сорбитола с использованием 14С-диметилсульфоксида как индикатора рН. Следует помнить, что определение АрН и Дф в значительной мере опирается на расчеты и что существуют трудности, связанные со специфическим и неспецифическим связыванием заряженных частиц биополимерами. Однако часто важно бывает узнать не абсолютные значения АрН или Дф, а их изменения.

Рамос и сотр. [35, 36] разработали и подробно описали метод проточного диализа, не требующий разделения клеток и суспендирующей среды. Этот метод особенно полезен при исследовании мембранных везикул.

В последние годы разработаны методики [33] для определения внутриклеточного рН у бактерий с помощью ядерного магнитного резонанса. Можно также определять рН;, используя флуоресцентные красители, такие, как пирамин '[20]. Зная рН/, легко определить рН0 с помощью стеклянного электрода и затем вычислить АрН.

19.3.2. Осмотически чувствительные клетки

Поглощение клеткой растворенного вещества приводит к снижению активности воды внутри клетки и последующему притоку воды извне, в результате чего клетка набухает. Биологические мембраны хорошо пропускают воду, и набухание происходит чрезвычайно быстро. Например, Мэттс и Ноулз [30] методом остановленной струи установили, что осмотический выход воды из

ЧАСТЬ tv. МЕТАБОЛИЗМ (

Рнс. 19.3. Осмотические Изменения объема бактериальных клеток. Прерывистая линия — идеальное поведение в соответствии с уравнением Вант-Гоффа — Бойля. Сплошная линия — реальное поведение.

Осмотически мертвое пространство

Осшляльность

клеток Е. coli, помещенных в 0,4 М раствор MgCb, завершается при 37 °С за 50 мс. Поскольку движение воды столь стремительно, скорость набухания, сопровождающего поглощение растворенного вещества, можно связать непосредственно со скоростью транспорта. Нужно, однако, подходить к этому с некоторой осторожностью, особенно в отношении тех бактериальных клеток, стенки которых достаточно эластичны, чтобы сопротивляться набуханию. (Да, именно эластичность, а не жесткость, как обычно предполагают, противостоит набуханию. Физические свойства бактериальных клеточных стенок рассматриваются в обзоре Роджерса [38].)

Набухание и сжатие идеального осмометра можно предсказать с помощью уравнения Вант-Гоффа—Бойля

V — b~a/Ut

где V—общий объем клетки, Ъ — так называемый осмотически мертвый объем (который обычно приблизительно равен вычисленному объему сухого вещества клетки), а — константа (число осмолей в клетке) и П — осмоляльность суспендирующей среды. График зависимости V от 1/П для идеального осмометра представляет собой прямую линию с пересечением оси у в точке b и наклоном а, тогда как действительное поведение бактериальных клеток описывается кривой (рис. 19.3). Очевидно, что бактерии не являются идеальными осмометрами.

Реакция на изменение осмоса заметно снижается в средах с высокой осмоляльностью, и экспериментально определяемое значение Ь можно получить только путем экстраполяции. Причины аномального поведения в концентрированных средах неизвестны. Оно может быть обусловлено связыванием воды и загустением цитоплазмы или же снижением проницаемости для воды.

В разбавленных средах бактериальные клетки резистентны к осмотическому набуханию в основном благодаря эластичности их стенок. В концентрированных же средах они подвергаются плазмолизу, т. е. протопласт сжимается так, что мембрана отстает от стенки и между стенкой и мембраной протопласта образуются плаз-молизные вакуоли. Их часто можно увидеть под микроскопом, особенно у грамотрицательных бактерий. Но даже если они не видны под микроскопом, их присутствие можно выявить путем измерения проницаемости. Можно, например, определить общий объем как пространство, непроницаемое для декстрана. Объем протопласта примерно равен объему, непроницаемому для рафи-нозы в условиях, когда рафиноза не проникает через мембрану протопласта. Тогда суммарный объем воды в клеточной стенке и плазмолизных вакуолях равен разности между объемами, непроницаемыми для декстрана и для рафинозы. Объем, занимаемый водой в клеточной стенке, можно оценить по величине объема, доступного для рафинозы, в набухших, неплазмолизированных клетках.

Если плазмолизированные клетки вновь поместить в более разбавленную среду, то вода поступит в протопласт через водопроницаемую мембрану и протопласт набухнет; он займет пространство, ранее занятое плаз-молизными вакуолями, и оптическая плотность суспензии возрастет. Между объемом протопласта и величиной, обратной оптической плотности, существует прямая зависимость [27]. Когда протопласт только начинает набухать, сопротивление набуханию незначительно и процесс протекает почти идеально, т. е. подчиняется уравнению Вант-Гоффа—Бойля. Но когда протопласт смыкается с клеточной стенкой, ее эластичность препятствует дальнейшему набуханию, и это приводит к существенному отклонению от идеального процесса. Теперь при поглощении воды возрастает объем не только протопласта, но и всей клетки, так что клеточная стенка растягивается.

Излом кривой зависимости V от 1/П происходит в так называемой точке начала плазмолиза. Дальнейшее снижение осмоляльности среды приводит к возникновению и нарастанию тургорного давления. Предполагается, что осмоляльность среды в точке начала плазмолиза приблизительно равна внутренней осмоляльности клетки (это состояние для растительных клеток рассматривал Стеделман [6]). Внутреннюю осмоляльность можно также определить, зная константу а (число идеальных молярных эквивалентов внутри клетки) и объем протопласта. Результаты, полученные двумя этими способами, обычно достаточно хорошо согласуются.

Эластичность клеточной стенки не влияет на набухание выделенных протопластов, часто используемых в работах по транспорту, и, по-видимому, мало влияет на сферопласты, у которых сохраняются остатки стенок. Если, однако, протопласты заставить набухать медленно, так чтобы их мембраны не разрывались, мембрана может стать упругой и степень набухания нельзя будет предсказать с помощью уравнения Вант-Гоффа — Бойля [27].

Как уже упоминалось, величина, обратная оптической плотности, может служить показателем клеточного объема и, следовательно, поглощения растворенного вещества, хотя, конечно, следует всегда помнить, что на самом деле в таких опытах наблюдают за перемещением воды.

Важно также знать, что оптическая плотность зависит от разницы показателей преломления клетки и суспендирующей среды и что может потребоваться внесение поправок на изменение показателя преломления среды в результате повышения или понижения концеш-рации растворенного вещества. В идеале желательно было бы иметь суспендирующую среду с изменяющейся концентрацией растворенного вещества, но постоянным показателем преломления. Нередко при изучении поглощения растворенных веществ наружная концентрация изменяется незначительно, и поэтому поправок не требуется. Однако при изучении изменений осмотического объема концентрации, как правило, сильно варьируют. У солевых растворов показатель преломления при изменениях концентрации растворенных веществ изменяется меньше, чем у растворов Сахаров. Однако в обоих случаях может потребоваться поправка величины мутности на изменение показателя преломления. Целесообразно иметь растворы полимерных декстранов, сильно различающиеся по показателю преломления, но с низкой ос-моляльностью. Тогда можно было бы, например, приготовить концентрированный раствор сахарозы с высоким показателем преломления и высокой осмоляльностью и раствор декстрана Т2000 с таким же показателем преломления, но почти нулевой осмоляльностью. Эти два раствора можно было бы смешивать в различных пропорциях, получая растворы с различной осмоляльностью, но одинаковым показателем преломления. Приращение показателя преломления (а) для углеводов равно 0,00143; показатель преломления п раствора углевода можно вычислить по формуле n = ns + aC, где ns — показатель преломления воды (1,33252 при 25 °С), а С — концентрация углевода в граммах на 100 мл раствора. Можно, конечно, определять показатели преломления растворов и с помощью рефрактометра.

Использование плазмолизированных клеток при изучении транспортных процессов подробно описали Мэло-ни и др. '[3]. Применение протопластов описано Абрам-сом [7].

19,3.3. Неметаболизируемые аналоги для раздельного изучения транспорта и метаболизма

Во многих случаях при изучении транспорта желательно отделить собственно транспортный процесс от последующего метаболизма, особенно в тех случаях, когда нужно продемонстрировать концентрирующее поглощение. В отношении фосфотрансферазных систем полная диссоциация двух процессов невозможна. Существуют три основных способа отделения транспорта от метаболизма: 1) с помощью неметаболизируемых, но транспортируемых аналогов; 2) путем использования мутантов с блокированным метаболизмом, но сохраненным

Таблица 19.1. Примеры неметаболизируемых аналогов, используемых для изучения транспорта у бактерий

Метаболизнруемый субстрат

Аналоги

Источник данных

Лактоза (р-галактозид)

Глю

страница 82
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.11.2019)