d (разд. 13.9.7) культуры штамма, на котором собираются вести испытания. К этим компонентам добавляют также 100 мкл (или больше) испытываемого вещества и 0,5 мл смеси S-9.

2. Получившуюся смесь сразу же перемешивают с помощью встряхивателя типа Vortex, работающего в медленном режиме, или вращением пробирки между ладонями и выливают на поверхность находящегося в чашке минимального агара с глюкозой (разд. 13.9.10).

3. Осторожными движениями покачивают чашку, чтобы верхний слой агара распределился равномерно. Вся процедура в целом занимает не более 20 с.

4. Дают агару застыть в темноте за несколько минут; затем переворачивают чашку вверх дном и инкубируют в темноте при 37 °С.

5. Через 2 дня инкубации отмечают колонии гисти-диновых ревертантов и убеждаются в наличии слабого фонового роста бактерий в агаре благодаря небольшому количеству гистидина, добавленного к среде. Чтобы выяснить, нуждается ли то или иное вещество в предварительной активации, имеет смысл проводить испытания как в присутствии, так и в отсутствие смеси S-9. Помимо опытных чашек должны быть и контрольные, содержащие: 1) только культуру бактерий, 2) бактерии с известными мутагенами (включая такой, который заведомо требует активации), 3) бактерии со смесью S-9 (без мутагена) .

Если мутагены нужно проверить нанесением на диски, их не включают в состав смеси верхнего слоя агара, а наносят позже по нескольку кристаллов, растворенных в воде, спирте или диметилсульфоксиде, на поверхность стерильных бумажных дисков диаметром 6 мм. Для некоторых веществ этот метод мало эффективен, вероятно, из-за их адсорбции на фильтре. В некоторых случаях мутагены наносят непосредственно на поверхность агаpa, правда, для получения положительного результата с плохо растворимыми веществами требуются довольно большие концентрации.

Возможные трудности

Предупреждение. Используемая в экспериментах S. typhimurium относится к микроорганизмам, патогенным для человека (класс II). Эта бактерия является одним из главных возбудителей пищевых отравлений и в случае попадания внутрь может вызывать тяжелые формы поноса, рвоты, гастроэнтерита. Несмотря на слабую вирулентность лабораторных штаммов, особенно тех, которые лишены липополисахаридной капсулы, обращаться с ними следует очень осторожно. Все пипетки должны быть снабжены ватными пробками, а материал, содержащий эту бактерию, нельзя насасывать в пипетку ртом. Перед удалением культуры должны автоклавиро-ваться. Сотрудники лаборатории, принимающие антибиотики, должны быть особенно осторожны при работе со штаммами, плазмиды которых детерминируют R-фактор.

Большая осторожность необходима и в обращении с высокотоксичными мутагенами, обладающими канцерогенными свойствами. Исследования этих веществ лучше всего проводить в специально отгороженном от остальной лаборатории помещении. Взвешивание опасных материалов и разлив по чашкам агара верхнего слоя, содержащего мутагены, нужно проводить под тягой. Инкубируют пробы также под хорошей тягой, причем вытягиваемый воздух должен поступать в канал, не сообщающийся с общим каналом тяги лаборатории. Сотрудники должны проводить эксперименты в лабораторных халатах и перчатках, а при работе с летучими препаратами использовать респираторы.

При интерпретации результатов нужно учитывать, что метод нанесения исследуемого вещества на поверхность агара (спот-тест), будучи полезным при обследовании большого числа изучаемых мутагенов, дает только качественные данные. Он мало приемлем для таких химических агентов, которые, как большинство водоне-растворимых полициклических углеводородов, не диффундируют в агар. Даже при использовании более чувствительного и допускающего количественную оценку метода наслоения (внесения исследуемого вещества в расплавленный агар верхнего слоя) важно проверять несколько различных концентраций исследуемых веществ, чтобы определить, имеется ли линейная зависимость индукции обратных мутаций от концентрации. В случае выраженной гибели бактерий исследуемого штамма, что проявляется в ослаблении роста бактериального газона, необходимо убедиться в том, что это происходит на линейном участке кривой доза — ответ, а не при тех концентрациях, когда степень летальности клеток относительно преобладает над мутагенностью. Степень летальности клеток можно определить сравнением действия данного вещества на нормальный штамм, используемый в пробе, и на штамм с нарушенной системой репарации (uvrB). Другой фактор, влияющий на результаты, — фракция S-9. Мутагенный эффект может несколько изменяться от одного образца фракции S-9 к другому, поэтому желательно проверять каждый новый образец в различных концентрациях с несколькими стандартными веществами, такими, как 2-аминофлуорен, 7,12-диметилбензантрацен и афлатоксин В1 [8].

Вещество обычно считается немутагенным, если 1 мг этого вещества при исследовании включением в агар не дает двукратного увеличения числа обратных мутаций по сравнению с фоном спонтанных обратных мутаций. Некоторые вещества при стандартной постановке пробы включением в агар проявляют слабую мутагенность. Для таких соединений чувствительность пробы можно повысить, проведя 30-мин преинкубацию в растворе перед посевом. Чтобы провести преинкубацию, смешивают в указанной последовательности в стерильной стеклянной пробирке: ОД мл раствора исследуемого вещества, 0,5 мл смеси S-9 и 0,1 мл бактериальной культуры. Инкубируют 30 мнн при 30 °С (или 20 мин при 37 °С), слабо перемешивая. Добавляют 2 мл агара верхнего слоя (разд. 13.9.20), перемешивают и выливают в чашку с нижним слоем минимального агара М56 (разд. 13.9.10). Инкубируют и учитывают колонии, так же как в случае стандартной процедуры.

Случается, высокая частота спонтанных обратных мутаций у используемых штаммов смазывает истинную картину. Как правило, это происходит из-за присутствия в среде мутагенов. Возможно, эти мутагены содержатся в некоторых партиях питательного бульона; поэтому для выращивания штаммов, используемых в опытах, рекомендуется бульон Oxoid (разд. 13.9.7). Кроме того, отдельные партии пластмассовых чашек Петри разового пользования могут содержать значительное количество окиси этилена, мутагенной по своей природе. В настоящее время можно приобрести чашки Петри, которые не стерилизуются окисью этилена (разд. 13.10.2).

13.9. РЕЦЕПТЫ СРЕД

13,9.1. L-Бульон

(для Е. coli и других энтеробактерий)

Гриптон 10 г

Дрожжевой экстракт 5 г

NaCI 0,5 г

Дистиллированная вода 1 л

Доводят рН до 7,0 добавлением 1 н. NaOH и авто-клавируют 15 мин под давлением 105 Па при 121 °С. После автоклавирования добавляют 10 мл стерильного 20%-ного раствора декстрозы.

13.9.2. ЬАгар

Добавляют 15 г агара на 1 л L-бульона и разливают по 20—25 мл в чашки Петри (100X15 мм).

13.9,3. Лактозо-тетразолиевая среда

Среда № 2 (для определения устойчивости к антибиотикам) 25,5 г

Дистиллированная вода 950 мл

2,3,5-Трифенилтетразолийхлорид (Sigma Chemical

Со) 50 мг

Сначала растворяют среду № 2, затем добавляют к ней тетразолийхлорид и нагревают до тех пор, пока он не растворится полностью. Автоклавируют 15 мин при

121 °С, добавляют 15 мл стерилизованного отфильтрованного 20%-ного раствора лактозы после автоклавиро-вания и разливают в чашки Петри размером 100X15 мм.

13.9.4. Трис-малеиновый буфер (ТМ-буфер)

Трис 6 г

Малеиновая кислота 5,8 г

(NH4)2S04 1,0 г

FeS04-7H20 0,25 мг

Добавляют дистиллированной воды до 1 л, доводят рН (если это необходимо) до 6,0 и автоклавируют в течение 15 мин при 121 °С. После охлаждения среды до температуры около 50 °С добавляют в стерильных условиях:

MgS04-7H20 0,1 г

Ca(N03)2 5 мг

13.9.5. Сульфаниламидный бульон

Минимальную солевую среду М56 (разд. 13.9.8) дополняют следующими компонентами:

Смесь казаминовых Урацил 2,5 мкг/мл

кислот, не содер- 5-Бромурацил 50 мкг/мл

жащая витаминов 0,1% L-Триптофан 20 мкг/мл

Ксантин 25 мкг/мл Сульфаниламид 1 мкг/мл

13.9.6. Na-ацетатный буфер

NaC2H302-3H2O 13,6 г

Дистиллированная вода 1 л

Доводят рН до 4,6 добавлением концентрированной уксусной кислоты.

13.9.7. Бульон Oxoid

Среда Oxoid № 2 25 г

Дистиллированная вода 1 л

Стерилизуют автоклавированием в течение 15 мин при 121 °С.

13,9.8. Минимальная среда М56

Na2HP04-7H20 8,2 г

КН2Р04 2,7 г

(NH4)2S04 1,0 г

FeSO4-7H20 0,25 мг

Добавляют дистиллированной воды до 1 л, доводят рН до 7,2 и автоклавируют 15 мин при 121 °С (105 Па). После охлаждения среды до температуры около 50 °С добавляют в стерильных условиях:

MgS04-7H20 0,1 г

Ca(N03)2 5 мг

Для использования этой смеси в качестве ростовой среды добавляют 10 мл стерильной 20%-ной глюкозы.

13.9.9. Среда М56/2

Среду М56 разводят стерильной дистиллированной водой в отношении 1:1.

13.9.10. Минимальный агар М56

Готовят минимальную среду М56 (разд. 13.9.8), автоклавируют, добавляют 10 мл 20%-ной глюкозы и соответствующие наборы аминокислот и витаминов. 1 объем полученной среды М56 добавляют к 1 объему 3,2%-ного агара (32 г агара на 1 л воды). Среду и агар автоклавируют порознь при 121 °С. Хорошо перемешивают, дают раствору отстояться до выхода всех пузырьков воздуха и разливают по чашкам.

13.9.11. Питательный бульон

(среда общего назначения)

Порошок питательного бульона 8 г

Дистиллированная вода 1 л

13.9.12. Питательный агар

Порошок питательно- или

го бульона 8 г Питательный агар 23 г

Агар 15 г Дистиллированная

Дистиллированная вода 1 Л

вода 1 л

Автоклавируют при 121 °С (105 Па) в течение 15 мин

и разливают по 20—25 мл в чашки Петри размером

100X15 мм.

13.9.13. Бульон Penassay

(для Bacillus subtilis и других бактерий)

Среда для определения

антибиотиков Difco № 3 17,5 г

Дистиллированная вода 1 л

или

Мясной экстракт 1,5 г

Дрожжевой экстракт 1,5 г

Пептон 5,0 г

Декстроза 1,0 г

NaCl 3,5 г

КН2Р04 1,32 г

К2НРО4 3,68 г

Дистиллированная

вода 1 л

Автоклавируют при 121 °С в течение 15—20 мин.

13.9.14. Агар с антибиотиками

К автоклавированному питательному а