Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 3

Автор Ф.Герхардт

из них используют для посева методом отпечатков в 9 других чашек с различными соединениями углерода, а затем в последнюю чашку с агаром, содержащим дрожжевой экстракт, для того чтобы проверить, имел ли место перенос всех штаммов. Чашки просматривают через 48 и 96 ч и результаты учитывают следующим образом: рост не лучше чем на контрольной чашке без источника углерода 0; хороший рост +; рост недостаточно хороший, однако существенно лучший чем на контрольной чашке ±; запоздалый рост нескольких колоний на месте мазка, которые предположительно возникли из мутантов, содержавшихся в инокуляте +М. Когда штаммы с сильно различающимися потребностями в питательных веществах высевают на одну чашку, может происходить перекрестное питание (за счет диффузии питательных веществ, продуцируемых одним штаммом, к примыкающим колониям других штаммов, что приводит к ложноположи-тельной реакции) или один штамм может мешать росту другого. Поэтому после первоначального произвольного скрининга проводят второй скрининг, используя иное расположение колоний штаммов в матричной чашке.

20.2.6. Ауксанографический метод определения потребностей в питательных веществах

Расплавленную основную агаровую среду (при температуре 45—50°С) без источников углерода инокулируют отмытой суспензией испытуемого микроорганизма. Погружают края стерильных дисков из фильтровальной бумаги в стерильные растворы различных соединений углерода, позволяя жидкости импрегнировать диск. Эти диски можно сразу же положить на поверхность иноку-лированного агара в чашках, или же их можно хранить до использования в высушенном состоянии в стерильном контейнере. Диски располагают по краю чашки Петри (3—4 диска на чашку) или на больших поверхностях инокулированного агара (например, разлитого в пирексовые противни) на соответствующем расстоянии друг от друга. После инкубации проверяют наличие зон роста (помутнения) вокруг диска, свидетельствующих об использовании источника углерода. В некоторых случаях рост наблюдается только в виде линии между двумя дисками; это, по-видимому, означает, что организму требуются оба источника углерода. Рост по всей поверхности агара может быть вызван слишком густым посевом; в таком случае следует применять более разбавленный инокулят.

20.2.7. Нитрогеназная активность и азотфиксация (см. также разд. 17.6.10)

Метод, основанный на восстановлении ацетилена, позволил относительно легко по сравнению с методами включения 15N2 определять нитрогеназную активность у бактерий, хотя методы включения 15N2 по-прежнему остаются наиболее точными. Принцип метода восстановления ацетилена основан на способности нитрогеназ-ного комплекса ферментов восстанавливать ацетилен до этилена. Испытуемый микроорганизм культивируют в условиях, способствующих образованию нитрогеназы. Затем в сосуд с культурой добавляют газообразный ацетилен и после инкубации определяют образование этилена. Контрольные культуры на средах, содержащих ионы аммония, которые подавляют синтез нитрогеназы (за исключением Rhizobium), образуют мало этилена или вообще не образуют его. Подробное описание метода восстановления ацетилена и его применения приводится в ряде работ [4, 5, 11].

Важно культивировать организмы в условиях, способствующих синтезу нитрогеназы. Это требует использования среды, не содержащей связанного азота, но содержащей нужный источник углерода и энергии, а также источник молибдена. Кроме того, необходимо обеспечить соответствующую газовую атмосферу. Для анаэробных организмов, таких, как Clostridium pasteu-rianum, необходимы анаэробные условия. Анаэробные условия благоприятны также для синтеза нитрогеназы у факультативных анаэробов, таких, как Klebsiella. Многие азотфиксаторы для роста и образования энергии нуждаются в кислороде, но устойчивость к кислороду для роста в условиях азотфиксации у таких организмов сильно различается. Например, Azospirillum лучше всего растет в условиях азотфиксации при концентрации кислорода около 1% и не растет вообще на воздухе (21% кислорода), тогда как Azotobacter является аэротолерантным. Однако даже аэробные азотфиксаторы обычно лучше фиксируют азот при более низком уровне кислорода, чем в воздухе.

Аэробные азотфиксаторы

Микроорганизмы выращивают на (или в) солевой среде (твердой или жидкой) в пробирках, закрытых ватными пробками, или в пенициллиновых флаконах. Примером такой среды является среда Бёрка для Azotobacter (разд. 20.3.9). Иногда для инициации роста желательно добавлять небольшое количество источника связанного азота (например, 0,0001—0,005% дрожжевого экстракта). В конце инкубационного периода ватную пробку заменяют стерильной пенициллиновой пробкой. Газообразный ацетилен собирают (внимание: огнеопасно!) в вытяжном шкафу следующим образом 111]. В пробирку, наполовину заполненную 15 мл воды, добавляют кусочек (около 1 г) карбида кальция. Пробирку немедленно закрывают пробкой с отверстием, через которое она с помощью резиновой трубки соединяется с химическим стаканом с водой, куда погружен конец трубки. После того как ацетилен вытеснит воздух из трубки, но все еще продолжает образовываться, его отбирают из трубки шприцем с иглой для подкожных инъекций № 26. Ацетилен вводят в сосуд с культурой через резиновую пробку до концентрации 10% (по объему). Через различные промежутки времени инкубации отбирают шприцем пробы газа по 1 мл из сосуда с культурой и проверяют наличие этилена методом газовой хроматографии (см. ниже).

Факультативно анаэробные и анаэробные бактерии

Очищенный от кислорода и пропущенный через фильтр газообразный азот пропускают через стерильную культуральную среду, помещенную в пробирки, и одновременно инокулируют среду. Пробирки закрывают стерильными пенициллиновыми пробками. Для факультативно анаэробных бактерий, таких, как Klebsiella,

строго анаэробные условия не обязательны, так как клетки сами могут использовать небольшие остаточные количества кислорода и создавать высокоанаэробные условия. Примеры сред приведены в разд. 20.3.35 (для Klebsiella), 20.3.13 (для Clostridium pasteuria-пит) и 20.3.16 (для Bacillus) .

Рис. 20.3. Пробирка Панкхурста.

1 — большая пробирка (1,9х

Х15,7 см) с культурой;

2 — соединительная трубка

(0,8X1,8 см) с непогло-щающей ватой в качестве фильтра для газа;

3 — меньшая пробирка (1,9х

Х6,0 см) с гигроскопической ватой для щелочного пирогаллола.

Можно также использовать пробирки Панкхурста объемом 40 мл (Asteli Laboratory Service Co., Ltd., London S.E. 6, England) [23]. Пробирка Панкхурста (рис. 20.3) состоит из двух пробирок (одна из которых больше, а другая меньше по размеру) и горизонтальной соединительной трубки, заполненной несорбирующей ватой в качестве фильтра для газа. В большую пробирку наливают 5—10 мл культуральной среды и временно закрывают ватной пробкой. Среду стерилизуют автоклавированием. Охлажденную среду инокулируют и с соблюдением правил асептики закрывают обе пробирки стерилизованными пенициллиновыми пробками. Через систему пропускают газообразный азот (иногда в этой стадии нет необходимости; см. [11]), вставив в обе пробки иглы для подкожных инъекций, одну — для ввода газа, другую — для вывода. После пропускания газа иглы убирают и в меньшую пробирку вносят 0,75 мл насыщенного раствора пирогаллола, а затем 0,75 мл раствора, содержащего 10% (вес/объем) NaOH и 15% (вес/объем) К2С03Эти добавки впитываются небольшим кусочком сорбирующей ваты, заранее помещенной на дно меньшей пробирки, как показано на рис. 20.3. Добавленные химические вещества реагируют с остаточным кислородом, и удаляют его, благодаря чему создаются анаэробные условия. Если не пропускать азот через пробирку Панк-хурста, то для создания анаэробных условий требуется 2—3 ч, и в этот период для замещения удаленного* кислорода следует добавить приблизительно 12 мл молекулярного азота [11].

После того как культура вырастет, через резиновую» пробку вводят ацетилен до конечной концентрации 10% (по объему). Культуру инкубируют в течение различных периодов времени и шприцем отбирают пробы газа по-1 мл для газохроматографического обнаружения этилена.

Бактерии, нуждающиеся в микроаэробных условиях для азотфиксации

Полужидкие безазотные среды успешно используются для демонстрации восстановления ацетилена азот-фиксирующими спириллами (см., например, разд. 20.3.3, где описана среда для Azospirilium). Полужидкие среды можно инкубировать на воздухе, так как они обеспечивают градиент концентрации кислорода, направленный от поверхности среды вниз. Это позволяет микроаэрофильным бактериям расти при любом наиболее подходящем для них уровне содержания кислорода. Рост начинается в виде узкой полоски или тонкой пленки в нескольких миллиметрах ниже уровня поверхности среды; по мере увеличения числа клеток пленка уплотняется и приближается к поверхности среды. Пробирку не следует встряхивать во время роста или последующего добавления ацетилена, так как при любом повреждении пленки может открыться доступ кислорода к клеткам и инактивироваться нитрогеназа.

После начала роста в пробирке или флаконе ватную пробку заменяют пенициллиновой и впрыскивают ацетилен до конечной концентрации 10% (по объему). После инкубации в течение различных периодов времени отбирают пробы газа до 1 мл для газохроматографического анализа (см. ниже).

20. общая характеристика

Газовая хроматография (см. также разд. 16.3.4)

Используют газовый хроматограф с водородным пламенным детектором. Обычно длина колонки составляет 1,5 м, внутренний диаметр 2 мм. Колонку заполняют порапаком R или N (Waters Associates Inc., Fra-mingham, Mass.). Температура термостата колонки равна +50°С, причем ее можно поддерживать при любом постоянном значении в интервале от комнатной температуры до 80° С. В качестве газа-носителя используют азот со скоростью потока —50 см3/мин. Калибруют хроматограф имеющимся в продаже этиленом (степень чистоты 99%), разбавленным азотом.

Пробы газа и стандарты этилена вводят пластмассовым шприцем одноразового пользования. Поскольку на пластмассовой поверхности шприца остается небольшое количество

страница 11
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 3" (2.64Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.11.2019)