этилена, после использования его выбрасывают и заменяют новым. Резиновые пенициллиновые пробки также могут загрязняться этиленом, их тоже нельзя использовать повторно.

На пенициллиновых пробках или резиновой прокладке дозатора газового хроматографа могут оставаться отверстия от игл. Во избежание этого кончик иглы загибают, как показано на рис. 20.4.

Рис. 20.4. Схематическое изображение кончика иглы шприца. Справа показано, как надо загнуть его, чтобы при прохождении иглы через пробки от пенициллиновых флаконов или резиновые перегородки в них не оставались дырки.

В процессе хроматографирования проб газа, содержащих и ацетилен, и этилен, ацетилен выходит из кочасть v. систематика

лонки с порапаком позже, чем этилен. Нельзя вводить в хроматограф новые пробы, пока ацетилен от предыдущей пробы не пройдет через колонку.

20.2.8. Серология

Тесты на агглютинацию на предметных стеклах

Предпочтительно использовать предметные стекла с керамическими кольцами (ободками) диаметром около 14 мм. Однако можно применять и стеклянные пластинки, разделенные на квадраты со сторонами по 2,5 см карандашом-стеклографом. Лиофилизованную антисыворотку разводят в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. В одно из колец помещают каплю антисыворотки, а в другое — каплю физиологического раствора (0,85% NaCl) или нормальной сыворотки кролика. Выросшую культуру снимают петлей с поверхности агара и смешивают с каждой из капель до получения однородной клеточной суспензии без сгустков. Суспензия должна быть мутной, но не слишком густой. Пластинку покачивают с вращением в течение 1 мин для перемешивания клеток и жидкости, следя за тем, чтобы не расплескать суспензию, а затем проверяют ее визуально, рассматривая при ярком свете на темном фоне. Положительная реакция: клетки, взаимодействующие с антисывороткой, образуют комки (т. е. суспензия выглядит гранулированной или, при сильном взаимодействии, даже «свернувшейся»). Сгустки лучше всего видны при слегка наклонном положении стекла, когда жидкость стекает к его нижней границе. В контрольном опыте с физиологическим раствором или нормальной сывороткой слипания клеток не происходит. Если же оно все-таки наблюдается, то это может свидетельствовать о том, что имеют дело с шероховатой формой (R) вместо гладкой (S).

Примечание: смесь бактерий и антисыворотки не должна высыхать, так как иначе невозможно наблюдать какие-либо признаки агглютинации. Если смесь все же подсыхает, то опыт повторяют с большим количеством антисыворотки.

Предостережение: после завершения опыта пластинку погружают в контейнер с дезинфицирующим раствором (например, с 1%-ным ЛИЗОЛОМ). Руки и стол моют дезинфицирующим раствором. Это важно, так как во время смешивания клеток с антисывороткой мелкие капельки могут разбрызгаться по стеклу и попасть на поверхность стола. Антисыворотка не убивает бактерии.

Преципитиновый тест для идентификации стрептококков

Культуру выращивают в 40 мл бульона Тодда — Хьюитта (разд. 20.3.33) в пластмассовых (поликарбонатных или полипропиленовых) центрифужных пробирках объемом 50 мл с завинчивающимися крышками. После инкубации при 37 °С в течение 18—24 ч культуру центрифугируют в бакет-роторе при максимальной скорости. Надосадочную жидкость осторожно сливают в колбу Эрленмейера с дезинфицирующим раствором и протирают крышку центрифужной пробирки полотенцем, смоченным дезинфицирующим раствором. Следует убедиться в том, что вся надосадочная жидкость слита и взмучивания осадка во время сливания не было. К осадку добавляют 0,5 мл физиологического раствора (0,85% NaCl) и суспендируют его, осторожно покачивая пробирку из стороны в сторону. Плотно завинчивают крышку и автоклавируют 15 мин при 121 °С. Снова центрифугируют при максимальной скорости, чтобы осадить автоклавированные клетки. Стараясь не взболтать осажденные клетки, переносят большую часть над-осадочной жидкости с помощью пастеровской пипетки в маленькую пробирку. Жидкость должна быть совершенно прозрачной; если она мутная, ее снова центрифугируют. В надосадочной жидкости содержатся растворимые антигены, экстрагированные из клеточных стенок стрептококков.

К антисыворотке добавляют воду согласно инструкции фирмы-изготовителя. В полученный раствор погружают в наклонном положении капиллярную трубку (с внутренним диаметром 0,7—1,0 мм и длиной 75— 90 мм) так, чтобы столбик сыворотки в ней достиг высоты 2—3 см. Закрыв противоположный конец указательным пальцем, капилляр извлекают из флакона с сывороткой и вытирают его внешнюю поверхность для удаления избыточной сыворотки. Затем конец капилляра с антисывороткой погружают в экстракт антигена и, убрав указательный палец, набирают 2—3 см раствора антигена. При продвижении экстракта вверх по капилляру между столбиками антисыворотки и антигена не должен попадать воздух. Закрывают конец капилляра указательным пальцем и капилляр вынимают. Наклоняют его почти горизонтально и, убрав палец, позволяют столбику жидкости двигаться к центральной части капилляра. У каждого конца трубки должно остаться не меньше 1 см воздуха. Один конец капилляра погружают в глину для лепки. Стирают с поверхности капилляра отпечатки пальцев и инкубируют 10—15 мин. Капилляр осматривают при ярком свете на темном фоне с помощью ручной лупы. Положительная реакция: появление легкого помутнения молочного цвета в центре капилляра на стыке антисыворотки и экстракта. При дальнейшей инкубации это помутнение увеличивается и на дне столбика жидкости выпадает осадок.

Реакция Квеллунга

Бульонную культуру наносят петлей на чистое предметное стекло и оставляют для высыхания на воздухе без подогревания. (Если в таком же мазке, окрашенном кристаллическим фиолетовым, присутствует более чем 15—25 клеток при просмотре в микроскоп с иммерсией, культуру следует разбавить, так как при слишком высокой концентрации клеток можно получить неточный результат.) К антисыворотке добавляют воду и наносят полученный раствор петлей на покровное стекло. Одну петлю 1%-ного водного раствора метиленового синего смешивают с антисывороткой и кладут покровное стекло каплей вниз на предметное стекло с высушенным мазком. Смотрят препарат в микроскоп с масляной иммерсией. Положительная реакция: капсулы вокруг окрашенных в синий цвет клеток становятся четко очерченными. Всегда следует проводить сравнение с контрольным препаратом, приготовленным с нормальной кроличьей сывороткой вместо антисыворотки. Если результаты теста отрицательные, необходимо повторить осмотр через 1 ч. Препарат предохраняют от высыхания, выдерживая его во влажной камере или герметизируя по краю покровного стекла расплавленным васпаром (смесью из равных объемов петролатума и вазелинового масла).

Тест с использованием флуоресцирующих антител

Флуоресцирующую антисыворотку («конъюгат») и флуоресцирующую нормальную сыворотку растворяют в воде. Готовят несколько порций флуоресцирующей антисыворотки, разбавляя ее каждый раз вдвое (например, 1:5; 1:10; 1 : 20; 1 : 40; 1 : 80) в фосфатном буфере с добавлением NaCl [фосфатно-солевой буфер (ФСБ), см, разд. 20.4.17]. При каждом разведении антисыворотки с помощью метода окрашивания, описанного ниже, а также с помощью подходящего флуоресцентного (люминесцентного) микроскопа (разд. 1.4) определяют степень флуоресценции бактериальных клеток по шкале 0, 1+, 2 + , 3-Ь, 4+ (максимум). Рабочее разведение антисыворотки составляет '/2 максимального разведения, которое дает степень флуоресценции 4 + . Например, если максимальная степень флуоресценции 4+ достигается при разведении сыворотки 1 : 20, то рабочее разведение равно 1 : 10. Эквивалентное разведение флуоресцирующей нормальной сыворотки не должно давать флуоресценции.

Молодую бульонную культуру испытуемого микроорганизма центрифугируют и надосадочную жидкость сливают. Клетки суспендируют в ФСБ и вновь центрифугируют. К осадку добавляют небольшое количество ФСБ, чтобы получилась густая суспензия клеток. С помощью алмазного или карбидно-вольфрамового карандаша очерчивают круг диаметром !Д размера предметного стекла. Стекло тщательно обезжиривают и внутри окружности делают мазок одной петлей бактериальной суспензии. Мазок высушивают на воздухе без нагревания, помещают предметное стекло на 1 мин в сосуд с 95%-ным этанолом, вынимают его и сушат на воздухе.

На мазок капают несколько капель рабочего раствора флуоресцирующей антисыворотки. Распределяют антисыворотку по мазку аппликатором, не касаясь мазка. Стекло препаратом вверх помещают в чашку Петри, к крышке которой прикреплен влажный кружок фильтровальной бумаги; такая чашка служит влажной камерой, в которой предотвращается высыхание антисыворотки. Инкубируют при 37 °С 15—20 мин.

Избыток антисыворотки сливают, наклоняя предметное стекло над фильтровальной бумагой. Затем стекло помещают в сосуд с ФСБ на 10 мин, периодически поднимая и опуская. Эту процедуру повторяют еще 2 раза, используя каждый раз сосуд со свежим ФСБ. После третьего погружения в ФСБ стекло опускают один раз в сосуд с дистиллированной водой для удаления ФСБ, сразу же промокают (не вытирают) фильтровальной бумагой и высушивают. На мазок наносят небольшую каплю забуференного глицерина (разд. 20.4.2) и накрывают его покровным стеклом. Просматривают мазок в люминесцентный микроскоп (разд. 1.4) при большом увеличении с масляной иммерсией или без нее. Когда смотрят с иммерсией, применяют только нефлуоресци-рующее масло (разд. 1.5).

Параллельно с окрашиванием испытуемого микроорганизма по той же методике готовят две контрольные пробы. Одну с рабочим раствором флуоресцирующей антисыворотки и известной бактерией, а другую с испытуемым микроорганизмом и раствором флуоресцирующей нормальной сыворотки. Степень флуоресценции первой контрольной пробы составляет 4 + , во второй пробе не должно быть флуоресценции.

Примечание: при рассматривании мазков в люминесцентный микроскоп следует часто менять поле, так как при наблюдении одного и того же поля флуоресценция быстро затухает (приблизительно через 15 с). Наиболее яркая флуоресценция наблюдается в тот момент, когда в