Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 3

Автор Ф.Герхардт

м плотно закупоривают для предотвращения абсорбции двуокиси углерода. Свежие растворы следует готовить каждый месяц.

20.4.3. Угольно-желатиновые диски [52]

15 г дегидратированной пищевой желатины (Difco Laboratories) смешивают со 100 мл водопроводной воды и смесь нагревают для растворения желатины. Добавляют 3—5 г мелко измельченного активированного угля, смесь хорошо встряхивают и разливают в чашки Петри слоем толщиной 3 мм. Смесь разливают достаточно охлажденной, для того чтобы она быстро затвердела до осаждения активированного угля. Рекомендуется перед разливом желатины смазывать дно чашки очень тонким слоем петролатума. После того как смесь затвердеет, ее вынимают из чашки и помещают в 10-%ный раствор формалина на 24 ч. Затем вырезают из затвердевшей желатины диски диаметром 1 см или полоски шириной 5—8 и длиной 20 мм. Полоски и диски заворачивают в марлю, опускают в сосуд, который помещают под кран с водой на 24 ч. Затем их кладут в бутыли с завинчивающимися крышками, заливают водой и стерилизуют 30 мин паром или повторным нагреванием в течение 20 мин в водяной бане при 90—100 °С (не автоклавируют!). После стерилизации сливают воду и помещают полоски или диски с соблюдением правил асептики в стерильные среды (по 1 полоске в пробирку). Среды инкубируют для проверки на стерильность, после чего они готовы для инокулирования.

20.4.4. Проявляющий раствор для аргинина [77]

а-Нафтол, 25%-ный (вес/объем) раствор в н-пропаиоле 20 мл Диацетил, 1%-ный (вес/объем) раствор в к-пропаноле 2,5 мл

Компоненты смешивают и разбавляют н-пропанолом до 100 мл.

20.4.5. Реактив Эрлиха

/г-Диметиламинобензальдегид 1,0 г

Этанол, 95%-ный раствор 95 мл

НС! (конц.) 20 мл

Альдегид растворяют в этаноле и затем добавляют кислоту. Хранят в холодильнике в защищенном от света месте.

20.4.6. Формиат-фумарат (Ф-Ф) [7]

Формиат натрия 3,0 т[

Фумаровая кислота 3,0 г

Дистиллированная вода 50 мл

Компоненты смешивают. Добавляют 20 гранул NaOH, размешивают до растворения этих гранул и фумаровой кислоты. Доводят рН смеси до 7,0, добавляя около 15 капель 4 н. NaOH, и стерилизуют фильтрованием.

20.4.7. Реактив Ковача

/г-Диметиламинобензальдегид 3,0 г

Пентанол или бутанол (амиловый или бутиловый спирт) 75 мл

НС1 (конц.) 25 мл

Альдегид растворяют в спирте при 50—55 °С. Раствор охлаждают, добавляют к нему кислоту и хранят в холодильнике в защищенном от света месте.

20.4.8. Реактивы для определения оптического вращения молочной кислоты [7]

Раствор хлорной кислоты (ХК): Хлорная кислота, 70%-ная 5,8 мл

Добавляют дистиллированную воду до 100 мл. Буферный раствор:

Глицин 3,75 г

Сульфат гидразина 5,2 г

Компоненты добавляют к 60 мл дистиллированной воды. Доводят рН смеси до 9,0, добавляя 8 н. NaOH, и разбавляют дистиллированной водой до 100 мл.

Раствор лактатдегидрогеназы (ЛД):

Лактатдегидрогеназа из мышц кролика (номер по ка- 0,8 мл

талогу L-2375; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)

Дистиллированная вода 0,8 мл

Раствор готовят в ледяной бане и хранят во льду. Его следует готовить в день применения.

Раствор NAD:

Никотинамидадениндинуклеотид (NAD, номер по ката- 0,160 г

логу N-7004; Sigma Chemical Co.)

Дистиллированная вода 8,0 мл

Растворяют NAD в воде; хранят в холодильнике; используют свежеприготовленный раствор.

20.4.9. Раствор метилового зеленого для теста на ДНКазу [85]

Метиловый зеленый (номер по каталогу М295, Certified 0,5 г Biological Stain, С. I. № 43590 Fisher Scientific Co., Pittsburgh, Pa.)

Дистиллированная вода 100 мл

Краситель растворяют в воде. Раствор экстрагируют приблизительно равными объемами хлороформа до тех пор, пока хлороформ не станет бесцветным (обычно 6—8 раз). Полученный водный раствор метилового зеленого хранят при 4°С. Краситель можно добавлять в среду для определения ДНКазы перед автоклавированием или его стерилизуют фильтрованием и добавляют с соблюдением правил асептики в автоклавированную среду при 45—50 °С.

20.4.10. Раствор Несслера

KI 5,0 г

Дистиллированная вода, 5,0 мл безаммиачная

KI растворяют в воде и добавляют насыщенный раствор HgCb (около 2,0 г в 35 мл) до образования осадка, свидетельствующего об избытке HgCl2. Затем добавляют 20 мл 5н. NaOH и смесь разбавляют до 100 мл. После оседания осадка сливают прозрачную надосадоч-ную жидкость.

20.4.11. Использование нильского голубого сернокислого для окрашивания жиров [12]

Раствор нильского голубого сернокислого. Готовят насыщенный водный раствор нильского голубого сернокислого. Добавляют 1 н. NaOH по каплям до прекращения образования осадка. Фильтруют и промывают осадок дистиллированной водой при рН 7,5. Высушивают и хранят до использования.

Окрашивание жира. Готовят насыщенный раствор оксазинового основания нильского голубого сернокислого, используя приготовленный ранее сухой осадок. Смешивают 1 мл раствора с 10 мл жира (триптопионина, трибутирина, трикапроина, трикаприлина, триолеииа, говяжьего сала, молочного жира, кокосового, кукурузного, хлопкового масла, свиного жира, льняного или оливкового масла). При необходимости смесь помещают в подогреваемую водяную баню для поддержания жира в жидком состоянии в течение всей последующей процедуры промывания.

Процедура промывания. В случае жиров, находящихся при комнатной температуре в жидком состоянии, к смеси красителя и жира в делительной воронке добавляют 2 объема диэтилового эфира. Эфирный красный слой отделяют от слоя воды и несколько раз промывают его водой. (Остороокно: эфир легко воспламеняется! Все процедуры с эфиром проводят в вытяжном шкафу, избегая огня или искр, в присутствии которых может произойти взрыв.) Наконец, отделяют эфирный слой, в котором находится жир, и выпаривают эфир. Отделяют жир от остатков воды, стерилизуют его автоклавированием и хранят в холодильнике. Перед применением добавляют 1 мл окрашенного жира к 10 мл расплавленной стерильной основной среды, хорошо перемешивают и разливают в чашки.

В случае жиров, находящихся при комнатной температуре в твердом состоянии, смесь красителя с жиром промывают несколько раз горячей водой и затем разливают жир в расплавленный нейтральный 0,5%-ный агар — по 10 мл жира на 90 мл агара. Стерилизуют автоклавированием. Перед использованием жир растапливают и вносят 1 мл жировой эмульсии в 20 мл расплавленной стерильной основной среды. Смесь хорошо перемешивают и разливают в чашки.

20.4.12. Реактивы для теста на присутствие нитритов

Метод 1.

Растор Л:

1М-(1-нафтил)-этилендиамнндигидрохлорид (Sigma 0,02 г Chemical Со.)

НС1, 1,5 н. раствор 100 мл

Смесь растворяют, осторожно нагревая в вытяжном шкафу.

Раствор Б:

Сульфаниловая кислота 1,0 г

НС1, 1,5 н. раствор 100 м'

Растворяют, осторожно нагревая на слабом огие.

Реактив получают, смешивая равные объемы растворов А и Б непосредственно перед использованием.

Метод 2.

0,6 г

(0,5 г) 100 мл

Раствор А:

N.N-диметил-1 -нафтиламиндигидрохлорид (Sigma Chemical Co.)

или нафтиламин) н. СНзСООН

Растворяют, осторожно нагревая в вытяжном шкафу. Раствор Б:

Сульфаниловая кислота 0,8 г

5 н. СНзСООН 100 мл

Растворяют, осторожно нагревая в вытяжном шкафу.

Осторожно: Управление по профессиональной безопасности и здоровью (OSHA) объявило а-нафтиламин канцерогеном. Хотя Ы-(1-нафтил)-этилендиамин и М,М-диметил-1 -нафтиламин не включены в список канцерогенов, их также можно считать опасными ввиду структурного сходства с а-нафтиламином. Поэтому следует соблюдать все предосторожности в отношении использования, обработки и последующего уничтожения этих соединений.

20.4.13. Реактив ОНФГ

Раствор А:

NaH2P04-H20 6,9 г

NaOH, 30%-ный (вес/объем) раствор 3 мл

Дистиллированная вода 45 мл

Фосфат натрия растворяют в диаиллированиой воде. Добавляя NaOH, доводят рН раствора до 7,0. Разбавляют дистиллированной водой до 50 мл и хранят при 4 °С.

Реактив для испытания:

о-Нитрофенил-р-Б-галактопиранозид (ОНФГ; Sigma 0,080 г Chemical Со)

Дистиллированная вода 15 мл

Раствор Л (см. выше) 5 мл

ОНФГ растворяют в дистиллированной воде при 37 °С. К раствору добавляют фосфат натрия и хранят его при 4° С. Перед использованием раствор нагревают до 37 °С.

20.4.14. рН-Индикаторы для культуральных сред

Список рН-индикаторов для культуральных сред приведен в табл. 20.1.

20.4.15. Суспензия гранул поли-р-гидроксибутирата ([29]; см. также разд. 17.3.8)

Источником гранул первоначально служил штамм Bacillus megaterium КМ (штамм АТСС 13632), однако им могут быть и штаммы Pseudomonas spp., для которых характерно высокое содержание поли-р-гидроксибутирата (ПГБ) (Palleroni, личное сообщение). Бактериальный штамм культивируют в условиях, способствующих образованию ПГБ. Для Л. megaterium такие условия описаны Макрэ и Уилкинсоном [58], для псевдомонад— Стейниером и др. [88]. Когда уровень ПГБ становится достаточно высоким, что определяют по окрашиванию Суданом черным (разд. 3.3.11), клетки собирают центрифугированием и суспендируют [в концентрации 15% (вес/объем)] в ледяном 0,02 М фосфатном буфере, рН 7,2 (разд. 20.4.16). Клетки разрушают ультразвуком (разд. 5.1.2) и центрифугируют при высокой скорости. Осадок суспендируют в щелочном гипо-хлоритном реактиве Уильямсона и Уилкинсона (разд. 20. 4.19) до плотности около 8 мг (сухого веса) на 1 мл [98]. Можно также использовать имеющийся в продаже 5%-ный гипохлорит, т. е. хлорную известь

(Palleroni, личное сообщение). Смесь инкубируют с перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 дней. Суспензию оставляют для осаждения осадка и затем либо осторожно сливают и выбрасывают надоса-дочную жидкость, либо собирают гранулы центрифугированием. Гранулы суспендируют в воде и диализуют против водопроводной воды до удаления ионов хлора

(тестируют на небольших порциях с помощью разбавленного раствора AgN03 до прекращения выпадения осадка AgCl). Затем проводят диализ против дистиллированной воды и несколько раз промывают гранулы ацетоном с помощью центрифугирования. Помещают гранулы в аппарат Сокслета и экстрагируют смесью ацетона и

страница 15
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 3" (2.64Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.11.2019)