Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 3

Автор Ф.Герхардт

Методы определения гомологии ДНК и РНК не заключают в себе трудностей ни в теоретическом, ни в практическом отношении, если для их осуществления подготовлен нужный материал. Технические трудности связаны с выделением ДНК и РНК и введением в них радиоактивной метки. Каждая группа микроорганизмов имеет в этом отношении свои особенности, поэтому универсальных рекомендаций не существует.

В настоящей главе описываются главным образом те методы, которые успешно зарекомендовали себя в моей лаборатории. Методы выделения и характеристики плазмидных ДНК рассмотрены в гл. 15.

22.1. РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОК ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Первый этап при выделении нуклеиновых кислот — это разрушение бактериальных клеток. В зависимости от природы клеточной стенки бактерии могут быть разрушены 1) с помощью одного лишь детергента, 2) с использованием сочетания действия детергентов и гидролитических ферментов или 3) с помощью физических методов, таких, как разрушение под действием ультразвука, в результате резкого изменения давления или при встряхивании со стеклянными шариками.

Грамотрицательные бактерии часто лизируются под действием одного лишь детергента, хотя имеется много исключений. В отличие от них почти все грамположи-тельные бактерии приходится сначала обрабатывать лизоцимом (гидролитическим ферментом, действующим на пептидогликан клеточной стенки), а затем уже применять детергент. Поэтому методы разрушения клеток для этих двух групп бактерий рассмотрены здесь отдельно.

22.1.1. Грамотрицательные бактерии

Клетки из культуры, находящейся в поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазе роста, центрифугируют и ресуспендируют их в солевом буфере с ЭДТА (0,15 М NaCI, 0,01 М Na-ЭДТА, рН 8,0) в объеме, составляющем от 7ю до V40 объема исходной культуры. Добавляют додецилсульфат натрия (ДСН) в виде 20%-ного (вес/объем) раствора до конечной концентрации 1%. Для ускорения лизиса колбу помещают в водяную баню при 50—60 °С и встряхивают. О начале лизиса свидетельствует быстрое увеличение вязкости и появляющаяся опалесценция.

Если бактерии плохо лизируются в этих условиях, то можно применять другие методики. Например, 1) используют более разбавленную клеточную суспензию; 2) клетки собирают в экспоненциальной фазе роста культуры, так как быстро растущие клетки более подвержены лизису; 3) добавляют лизоцим (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), проназу (Calbiochem-Beh-ring, La Jolla, Calif.) или протеиназу К (E. M. Laboratories, Inc., Elmsferd, N. Y.) к суспензии клеток в солевом буфере с ЭДТА и перед добавлением ДСН инкубируют при 37 °С. Во время инкубации периодически отбирают пробы для проверки на лизис под действием ДСН. В случае использования лизоцима клетки суспендируют в солевом буфере с ЭДТА, разбавленном в соотношении 1 : 5, так как растворы с большой ионной силой ингибируют действие фермента. Периодически отбираемые пробы испытывают на лизис под действием ДСН. Перед добавлением ДСН ионную силу буфера в основной клеточной суспензии восстанавливают до исходной.

Для разрушения клеток грамотрицательных бактерий, которые не лизируются с помощью описанных выше методов, основанных на применении детергентов, используют один из многочисленных физических методов. Палочковидные бактерии средней длины можно разрушить путем пропускания суспензии клеток через пресс Френча (American Instrument Co., Silver Springs, Md.) под давлением 84-106— 112-106 Па; для разрушения более коротких па'лочек или кокков может потребоваться более высокое давление, а именно 21-107— 23-107 Па. Дополнительную информацию см. в разд. 5.1.1 и 18.1.3. Ультразвуковые дезинтеграторы обычно менее эффективны для разрушения клеток, чем пресс Френча; дополнительные сведения по ультразвуковой дезинтеграции содержатся в разд. 5.1.2 и 18.1.3. Для микроорганизмов, которые нельзя разрушить этими методами, обычно применяют клеточный гомогенизатор фирмы Бронвилл (Bronwill Stientific Co., Rochester, N. Y.). Гомогенизатор включают на 4000 об/мин, используя равные объемы клеточной суспензии и стеклянных шариков (у Bronwill Stientific Со. можно приобрести стеклянные шарики диаметром 0,1 мм, а у Cotaphote Div., Ferro Corp., Jackson, Miss., — диаметром 0,074—0,110 мм, класс IV, № 1420, тип С). Дополнительная информация по этому вопросу содержится в разд. 5.1.3.

22.1.2. Грамположительные бактерии

Обычно для того, чтобы сделать грамположительные бактерии чувствительными к лизису под действием ДСН, клеточные стенки расщепляют лизоцимом, который добавляют к суспензии клеток в разведенном солевом буфере (1:5), как описано выше. Инкубационный период может составлять от нескольких минут до нескольких часов. Периодически отбирают пробы и проверяют клетки на лизис под действием ДСН. Перед добавлением ДСН к основной суспензии ионную силу буфера вновь увеличивают до исходного значения. Так же как в случае с грамотрицательными бактериями, лучше брать клетки в экспоненциальной фазе роста. Другие пути повышения способности грамположитель-ных бактерий лизироваться под действием ДСН заключаются в добавлении пенициллина к активно растущим культурам или в выращивании культуры при высоких концентрациях глицина [60].

Если размер фрагментов ДНК не имеет значения, то физическое разрушение клеток — процедура легкая и простая. Вообще, с помощью пресса Френча грамотри-цательные бактерии разрушаются легче, чем грамполо-жительные. Наш опыт показывает, что встряхивание со стеклянными шариками (т. е. с помощью гомогенизатора фирмы Бронвилл, как было описано выше) эффективно и для тех и для других бактерий. Во всех описанных ниже методиках можно использовать фрагментиро-ваннуго ДНК, однако для иммобилизации на нитроцеллюлозных фильтрах (разд. 22.6.5) и для введения метки in vitro (разд. 22.6.3) предпочтительна ДНК с большой молекулярной массой.

При определении температуры тепловой денатурации, или температуры плавления (7V, разд. 22.5.1), все препараты ДНК, включая ДНК-стандарт, должны обрабатываться одинаково.

22.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК

Выделение ДНК для изучения гомологии занимает больше всего времени и вызывает наибольшие технические трудности. Ниже описаны два метода выделения ДНК из 0,5—1,0 л культуры (если культура не доросла до достаточно высокой плотности, может потребоваться больший объем).

22.2.1. Метод Map мура [44]

По методу Мармура, который, вероятно, является наиболее распространенным, белок из лизата удаляют хлороформом. Ниже дано краткое описание этого метода.

Реактивы

Солевой буфер с ЭДТА: 0,15 М NaCl; 0,01 М ЭДТА, рН 8,0.

ДСН: 20%-ный (вес/объем) раствор. Перхлорат натрия: 5 М раствор.

Буфер SSC: 0,15 М NaCl, 0,015 М тринатрийцитрат, рН 7,0. Примечание. Иные концентрации буфера SSC обозначены в тексте следующим образом: 20Х (20-кратная концентрация) или 0,1 X (1/10 исходной концентрации) .

РибоНуклеаза (РНКаза): бычья панкреатическая РНКаза (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), 1 мг/мл в 0,15 M NaCI, рН 5,0. Раствор нагревают при 80°С в течение 10 мин для инактивации следов ДНКазы и хранят в холодильнике.

Методика

1. Отцентрифугированные клетки суспендируют в 50—100 мл солевого буфера с ЭДТА и разрушают одним из ранее описанных методов (разд. 22.1).

2. Добавляют перхлорат натрия до конечной концентрации 1 М.

3. Добавляют 0,5 объема смеси хлороформ —• изопен-танол и встряхивают 30 мин на качалке в колбе с притертой стеклянной пробкой. Скорость встряхивания должна быть достаточной для получения эмульсии, в то время как очень сильное встряхивание нежелательно.

4. Эмульсию центрифугируют при 17 000 g в течение 10 мин в центрифуге с охлаждением при температуре от 0 до 4°С.

5. Осторожно сливают или удаляют пипеткой верхний водный слой из каждой пробирки, стараясь не затронуть белый осадок (белок) на границе раздела фаз. Для этого 10-мл серологическую пипетку вставляют кончиком вверх в пипетку типа Propipette (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, Pa.). Водный слой содержит ДНК и поэтому отличается высокой вязкостью. Рекомендуется, отбирая жидкость, постоянно передвигать пипетку в пробирке из стороны в сторону во избежание захвата белка с поверхности.

6. Повторно экстрагируют лизат, выполняя операции 3—5.

7. Водную фазу помещают в химический стакан и медленно вливают туда холодный 95%-ный этанол (добавляют около двух объемов водной фазы). Осажденную ДНК собирают стеклянной лалочкой, осторожно размешивая обе фазы круговыми движениями. ДНК прилипает к палочке или наматывается на нее (рис. 22.1). Избыток этанола удаляют, прижимая палочку с ДНК к стенке стакана; затем для удаления остатков этанола палочку на несколько минут устанавливают вертикально

по, так чтобы ее конец, на котором намотана ДНК, был обращен вверх. Другим способом после добавления холодного этанола колбу встряхивают круговыми движениями. При этом образуется сгусток ДНК, который отделяют, сливая содержимое колбы в 50-мл полипропиленовую центрифужную пробирку, имеющую несколько отверстий на стенках (по всей окружности) и большое отверстие на дне (рис. 22.2). Перед вливанием содержимого колбы в пробирку необходимо убедиться в том, что большое отверстие закрыто пробкой. Затем осажденную ДНК промывают 1—2 раза буферно-этанольной смесью (1:2) и оставляют пробирку до полного стекания этанола.

8. Стеклянную палочку с налипшей ДНК помещают в 10—20 мл буфера 0,1 X SSC и держат там до размягчения ДНК и удаления ее с палочки. Если пользуются вторым способом, из отверстия на дне перфорированной пробирки вынимают пробку, ставят пробирку в небольшой химический стакан (или в другую пробирку с объемом, слегка превышающим объем полипропиленовой пробирки) и добавляют 10 мл буфера 0,1 X SSC. Сгусток ДНК начинает растворяться и при извлечении полипропиленовой пробирки проходит через ее нижнее отверстие. Перфорированную пробирку промывают второй порцией буфера (10 мл), которую объединяют с первой. Сгусток ДНК растворяется быстрее, чем ДНК, намотанная на палочку. После полного растворения ДНК концентрацию буфера SSC доводят до IX, добавляя необходимое количество буфера 20х SSC.

9. К препаратам ДНК до

страница 20
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 3" (2.64Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.09.2019)