логия РНК). Двухцепочечные комплексы цепей ДНК с радиоактивными цепями ДНК (или цепями РНК в случае изучения гомологии РНК), образующиеся в результате специфического взаимодействия, при последующем промывании фильтра не разрушаются, и их количество можно определить, измерив радиоактивность фильтра.

Другой метод изучения гомологии, который можно назвать методом реассоциации в растворе, основан на связывании одноцепочечных нуклеиновых кислот в растворе, т. е. в данном случае, в отличие от мембранного метода, когда один из компонентов связан, оба компонента находятся в растворе. За реассоциацией цепей ДНК можно следить с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии или, в случае инкубации небольшого количества денатурированной ДНК с высокой удельной радиоактивностью в присутствии большого избытка немеченой денатурированной ДНК, с помощью измерения радиоактивности. В последнем случае способность меченых фрагментов образовывать двухцепочечные комплексы с немеченой ДНК количественно определяют по адсорбции на гидроксилапатите или по устойчивости к гидролизу нуклеазой S1.

Оптические методы определения реакций в растворе в данной главе не рассматриваются. Они описаны в работах [1, 6, 12, 19, 51 и 59].

22.6.1. Специальное оборудование для изучения гомологии ДНК

На рис. 22.4—22.7 изображены некоторые специально сконструированные устройства для изучения гомологии ДНК. Реакционные сосуды (рис. 22.5) представляют собой пирексовые трубки с внешним диаметром б мм, нарезанные на отрезки длиной 2,2 см и запаянные на одном конце. Трубки закрывают пенициллиновыми пробками с обрезанными краями. Растворы наливают в реакционные сосуды с помощью автоматических микропипеток со сменными наконечниками (рис. 22.4, Д). Общий объем жидкости в каждом сосуде ПО мкл. Такого количества как раз достаточно для покрытия мембран, помещаемых в сосуды при изучении гомологии ДНК мембранным методом (рис. 22.5); в случае применения метода реассоциации в растворе такой объем

позволяет отобрать 100 мкл пробы для нанесения на гидроксилапатит или для реакции с нуклеазой S1. Компоненты вносят в реакционные сосуды, установленные в плексигласовый штатив (рис. 22.4, Л) с двойным рядом отверстий, позволяющий наблюдать за их внесением. После заполнения сосуды закрывают пробками и устанавливают в плексигласовом штативе (рис. 22.5) в водяную баню для инкубации. Размер бани должен быть достаточным для того, чтобы штатив был полностью погружен в воду, а колебания температуры пе должны превышать ±0,1 °С. При неполном погружении штатива возникает опасность испарения и скопления капель чистой воды на стенках сосудов и крышках, что сильно влияет на ионную силу и концентрацию нуклеиновой кислоты. При применении мембранного метода пользуются продолговатыми мембранными фильтрами (3x9 мм), которые вырезают из больших фильтров (диаметром до 15 см) с помощью пробойника (рис. 22.4, Г; номер по каталогу 5302, МсВее Systems,5 -6

Рис. 22.7. Схематическое изображение устройства для определения термостабильности гибридных двухцепочечньгх комплексов. Отрезок стеклянной трубки диаметром 7 мм (У) закрыт резиновой пробкой (5), вырезанной из большой резиновой пробки с помощью специального сверла. Мембранные фильтры (5) и тефлоновые прокладки (6) насажены на булавку (4) ближе к ее головке. Острие булавки вставлено в резиновую пробку. Трубка с булавкой находится в стеклянной пробирке (2) размером 13X10 мм, содержащей 1,2 мл буфера 0,5xSSC. Пробирку помещают в нагретую водяную баню.

Roanoke VA 23224). Форма фильтров может быть и иной, но продолговатый фильтр удобен тем, что он располагается в сосуде под углом (рис. 22.5). Такая форма обеспечивает максимальный контакт фильтра с раствором и высокое значение отношения поверхности к объему, а также облегчает его внесение в сосуд и извлечение. Мембранные фильтры отмывают от непрореаги-ровавших радиоактивных фрагментов в плексигласовой камере с 120 ячейками (рис. 22.4, В и 22.6). Камера состоит из верхней и нижней панелей; мембранные фильтры помещают в нижней панели, после чего привинчивают к ней болтиками верхнюю панель. В собранном виде камера достаточно компактна, она помещается в 400-мл химический сосуд.

Фильтровальные устройства, используемые для приготовления ДНК-мембран (мембран, к которым присоединена денатурированная ДНК), имеют встроенные фильтры из пористого полиэтилена. Основанием устройства служит невысокий цилиндр из плексигласа с таким же внешним диаметром, как у мембраны.

Пористый полиэтилен доверху заполняет внутреннюю часть цилиндра. От основания цилиндра отходит выходная трубка с зажимом для регулирования скорости потока. Верхняя часть прибора состоит из плексигласового цилиндра с неопреновой прокладкой (толщиной 3 мм), приклеенной к его нижнему краю. Верхнюю часть помещают на мембрану и закрепляют пружиной. Все приспособления из плексигласа можно изготовить в механической мастерской.

Термостабильность связанных с мембраной двух-цепочечных комплексов можно определить с помощью устройства, изображенного на рис. 22.7.

22.6.2. Получение меченой ДНК: метод in vivo

Для опытов по изучению гомологии можно вводить метку в ДНК in vivo или in vitro.

Введение метки в ДНК in vivo зависит от среды, необходимой для выращивания микроорганизмов, а также от включаемых ими предшественников нуклеиновой кислоты. Среди 3Н- или 14С-предшественников нуклеиновых кислот чаще других используют аденин, тимидин и дезоксиаденозин. Их включение обычно не подавляется дрожжевым экстрактом до концентрации его в среде 0,1 %, В некоторых случаях дрожжевой экстракт используют для подавления биосинтеза предшественников, что позволяет осуществлять их непосредственное включение в ДНК. Пригодность того или иного меченого предшественника можно легко определить, поместив его в пробирку со средой, инокулированной испытуемым организмом. После того как культура вырастет, с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика измеряют радиоактивность культуры, а также надосадочной жидкости после удаления клеток центрифугированием. Снижение числа импульсов в надосадочной жидкости по сравнению с культурой свидетельствует о включении метки. Включение 32Р043~ или 33Р043_ наиболее эффективно проходит в среде без пептона, содержащей не более 1,5* Ю-4 М фосфата. Если для роста культуры требуются пептоны и в особенности дрожжевой экстракт, фосфат можно удалить осаждением его в виде бариевой, кальциевой или магниевой солей.

Методика

Ниже приводится методика, описанная Хайесом и Гросом [31].

1. 100 г дегидратированного питательного бульона (Difco) и 50 г казаминовых кислот (Difco) растворяют в 900 мл воды.

2. Добавляют 50 мл 1 М ацетата бария. (При использовании других пептонов или дрожжевого экстракта необходимо путем титрования определить точное количество ацетата бария.) Осадок удаляют фильтрованием.

3. К фильтрату добавляют 5 мл 1 М сульфата натрия, оставляют на 15 мин и снова фильтруют. Проверяют наличие остаточного бария с помощью родизоно-вой кислоты (осадок красного цвета, выпадающий в результате образования бариевой соли родизоновой кислоты, можно наблюдать при концентрациях, в 10 раз-меньших, чем при осаждении в виде BaS04).

4. Доводят объем до 1 л и используют в виде концентрата (ЮХ) для приготовления меченой среды.

5. Выделяют ДНК из меченых клеток по методу, описанному в разд. 22.2, и растворяют ее в буфере 0,1 X SSC. В опытах по определению гомологии мембранным методом (разд. 22.6.5) используют ДНК в концентрации от 50 до 100 мкг/мл (удельная активность должна составлять не менее 103 имп/мин • мкг). Если применяют методе использованием гидроксилапатита или нуклеазы S1, то ДНК с удельной радиоактивностью 0,5 • 105—2,5Х X Ю5 имп/(мин*мкг) берут в концентрации не более 5 мкг/мл. При низкой концентрации ДНК добавляют около 30 мкг на 1 мл препарата фрагментированной ДНК из спермы лосося во избежание адсорбции меченой ДНК на стекле. Препарат ДНК дважды пропускают через пресс Френча под давлением 11.2-107 Па.

22.6.3. Получение меченой ДНК: метод in vitro

ДНК можно иодировать 1251, получая активность более 107 имп/мин* мкг. Мы не рассматриваем здесь процедуру иодирования, подробное описание ее дано в работах [16, 49, 52, 56].

Другим способом введения метки в ДНК in vitro, который находит все более широкое применение, является «ник-трансляция» [15, 37, 48, 50]. В этом случае сначала ДНК инкубируют с панкреатической ДНКазой I, под действием которой в ДНК образуются одноцепочеч-ные разрывы. Затем ДНКазу инактивируют, а ДНК инкубируют с полимеразой I Е. coli и натриевыми солями четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (один из которых является радиоактивным, обычно с меткой 3Н).

Реактивы и компоненты

Буфер трис —MgCl2: 0,05 М трис 4- 5 мМ MgCl2, рН 7,5. Готовят также в 10 раз более концентрированный буфер; после его разведения следует убедиться в правильности значения рН.

Бычья панкреатическая ДНКаза I (очищенная элек-трофоретически; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Ее растворяют в концентрации 1 мг/мл в 70 мМ буфере К2НРО4—КН2РО4, рН 7,4, содержащем 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (фракция Y, Sigma, Chemical Со.) и 50% глицерина. Хранят при —20°С. Этот же буфер используют для разведения ДНКазы до 0,1 и 0,01 мг/м*л.

ДНК-полимераза I Е. coli. Ее разводят до 200 ед/мл в том же буфере, что и ДНКазу. Хранят при —20 °С. В нашей лаборатории успешно использовались препараты, приобретенные у фирм Worthington Biochemical Corp. (Freehold, N. J) и Miles Biochemicals (Elkhart..

Ind.).

Меченый тимидин-5'-трифосфат (ТТФ, тетранатрие-вая соль) поставляется в 50%-ном водном этаноле с концентрацией 0,5—1 мКи/мкл.

Обработка ДНКазой для получения ДНК с одноцепочечными разрывами

Для этой цели предпочтительна ДНК с высокой молекулярной массой, однако можно использовать и ДНК» выделенную с помощью гидроксилапатита. Важно, чтобы она была очень чистой. Обработку ДНКазами осуществляют следующим образом.

1. Исходный раствор ДНК (например, в буфере 0,1 X SSC) разбавляют до ОД мг/мл в буфере трис + MgCl2. Если концентрация исходного