раствора около 0,2 мг/мл, добавляют в 10 раз более концентрированный буфер.

2. Добавляют по 10 мкл ДНКазы I (0,01 мг/мл) на каждый 1 мл раствора ДНК и инкубируют при 30 °С

1—2 мин.

3. Инактивируют фермент, нагревая реакционный сосуд в водяной бане при 60 °С в течение 10 мин. Растворы ДНК с одноцепочечными разрывами хранят при

—20 °С.

Методика

1. Радиоактивный нуклеозидтрифосфат наиболее устойчив при хранении в 50%-ном этаноле. Для предотвращения токсического влияния этанола на полимераз-ную реакцию вначале в реакционный сосуд добавляют меченый ТТФ, а затем перед добавлением остальных компонентов этанол выпаривают досуха в слабом токе N2.

Таблица 22.1. Состав смеси для проведения реакции в присутствии

ДНК-полимеразы I

Компонент

Количество

8Н-тимидин-5' трифосфат (New England Nuclear, Boston, Mass; выпаривают досуха перед добавлением остальных компонентов)

ДНК с одиоцепочечиыми разрывами

Трис-буфер, 0,7 М, рН 7,8

MgCb, 0,14 М

Дитиоэритритол, 0,01 М (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)

Раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов, содержащий ло 2 мМ каждого из следующих трифосфатов (Sigma Chemical Co.): 2-дезоксиаденозин-5'-трифосфат 2-дезоксицитидин-5/-трифосфат 2-дезоксигуанозин-5/-трифосфат Тимидин-б'-трифосфат (Sigma Chemical Co.), 0,80 мМ ДНК-полимераза I (Miles Biochemicals, Elkhart, Ind.), 200 ед/мл

10—15 мкКи

50 мкл 10 мкл 5 мкл 5 мкл

10 мкл

10 мкл 10 мкл

6. На полоски фильтровальной бумаги Whatman № 1 (шириной 1,3 см) с интервалом 2,5 см наносят по> 5 мкл каждой фракции элюата. Полоски высушивают, разрезают по отмеченным линиям, помещают во флаконы со сцинтилляционной жидкостью и измеряют радиоактивность.

7. Отбирают фракции из фронтальной части пика и пропускают раствор через пресс Френча под давлением 11,2* 107 Па. Меченая ДНК должна иметь удельную активность около 2 • 105 имп/мин*мкг и может быть разбавлена приблизительно до 2,6 мкг/мл в буфере 0,1 X XSSC, содержащем 30 мкг/мл ДНК из спермы лосося.

8. Препарат разбавляют до активности 6000— 8000 имп/мин'10 мкл с помощью буферного раствора., содержащего ДНК из спермы лосося (см. п. 5). Хранят при — 20 °С.

Замечания

Условия, необходимые для включения метки в ДНК in vitro, до некоторой степени произвольны, и успех порой зависит от случайности. Ниже дается несколько советов, которые помогут избежать некоторых наиболее часто встречающихся затруднений.

Перед введением метки препарат ДНК тестируют, используя 3Н-ТТР с низкой активностью. Разбавляют исходный 3Н-ТТР до 20 мкКи смесью этанол — вода (1 : 1, по объему) и вносят в реакционную смесь 10 мкл (0,2 мкКи) этого раствора (табл. 22.1). Готовят также контрольную пробирку с ДНК, заведомо способной включать ТТР. После инкубирования в течение 1—2 ч 25 мкл пробы обрабатывают 5—10°/о-ной ТХУ, собирают осадок на мембранном фильтре, определяют радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика и сравнивают с контролем. Оставшуюся часть пробы пропускают через колонку с биогелем Р100 (см. выше), собирают фракции 4—14 во флаконы Bio-vials (Beck-man Instruments, Inc., Fullerton, Calif.) и измеряют радиоактивность в сцинтилляционном счетчике, используя подходящую сцинтилляционную жидкость для водных образцов. Максимальная активность фронтальной части пика должна быть во фракциях 5 или 6. От 30 до 50% добавленного 3Н-ТТР должно быть включено в

ДНК, осаждаемую ТХУ. Меченую ДНК высокого качества элюируют при гель-фильтрации в виде острого пика с крутым фронтом. Радиоактивность во фракциях 9—12 составляет менее 5% радиоактивности во фракциях 5—б. Она соответствует осаждающимся ТХУ коротким фрагментам ДНК, не образующим двухцепочеч-ных комплексов.

Препараты ДНКазы из различных партий и источников имеют разные активности, поэтому ДНКазу предварительно титруют, инкубируя ее 10-мкл аликвоты, имеющие различную концентрацию (например, 0,1 и 0,01 мг/мл) с I мл ДНК в течение различных периодов времени и определяя максимальное включение метки.

Включение 3Н-ТТФ в основном зависит от качества ДНК. Присутствие в лизатах эндогенной ДНКазы может приводить к появлению большого числа одноцепо-чечных разрывов в ДНК. Если в ДНК нет разрывов, вызванных действием эндогенной ДНКазы, то без предварительной обработки ДНКазой (см. выше) включается лишь небольшое количество ТТР. Если же ДНК имеет достаточное число разрывов, то ТТР включается одинаково как после обработки ДНКазой, так и без нее. Иногда обработка ДНКазой приводит к образованию слишком большого числа разрывов, в результате чего появляются короткие фрагменты меченой ДНК (см. выше). Поэтому каждый препарат ДНК следует тестировать дважды: с обработкой и без обработки ДНКазой. Это позволяет определить количество включенного ТТР и качество меченого материала, как описано выше.

Регулируют включение ТТР путем изменения концентрации немеченого ТТР. Например, если включение 3Н-ТТР в ДНК, не обработанную ДНКазой, составляет лишь 15—20%, но качество его хорошее, а качество продукта из обработанной ДНКазой части того же образца низкое, то следует использовать не обработанный ДНКазой препарат и снизить концентрацию ТТР до ?,4 мМ (табл. 22.1).

22.6.4. Метод реассоциации в растворе

Реассоциацию фрагментов денатурированной ДНК в растворе можно измерить оптически с помощью регистрирующего спектрофотометра. Если ДНК обладает

Проба, в которой содержится одно-цепочечная меченая

AM +

Большое количество одноцепочечной конкурентной ДНК (немеченой)

Инкубация

МЕТОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГИДРОКСИЛАПАТИТА

Адсорбция двухцепочечных комплексов Ц ентрисругирование

Надосадочная Осадок

жидкость |

Элюирование двухцепочечных комплексов ДНК Q28M сроссратным буфером

\

\

Добавление дбух-цепочечной ДНК -носителя [ выделен-ной из лосося)

Осаждение ТХУ

измерение радиоактивности осадка, соответствующей реассоциироЪанной АПК

МЕТОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НУКЛЕАЗЫ 51

Добавление одноцепочечной ДНК лосося и нуклеазы S1

\

Гидролиз нуклеазой 5f одноцепочечной ДНК, двуосцепочечныв комплексы остаются негидролизованными

Осаждение ДНК ТА у I

измерение радиоактивности осадка, соответствующей

реассоциирооанной ДНК

Рис. 22.8. Схема метода изучения гомологии ДНК в растворе с использованием гидрокси л апатита и нуклеазы S1.

радиоактивностью, последнюю можно измерить по адсорбции на гидроксилапатите или по устойчивости к нуклеазе S1. Общая схема этих методик представлена на рис. 22.8. Обе они предусматривают инкубацию меченой ДНК с высокой удельной активностью (в очень малом количестве) с большим избытком фрагментов немеченой ДНК. Удельная активность должна составлять от 5 • 104 до 2,5 * 105 имп/мин • мкг, а концентрации ДНК должны быть ниже 5 мкг/мл.

Предварительные процедуры

Немеченая ДНК. И для разделения на гидроксилапатите, и для реакции с нуклеазой S1 немеченую ДНК готовят одинаково следующим образом.

1. Исходный препарат ДНК (разд. 22.2.2) разбавляют приблизительно до 0,9—1,0 мг/мл.

2. Каждый препарат обрабатывают ультразвуком дважды по 30 с (мы, например, используем ультразвуковой дезинтегратор Biosonic III с датчиком на 0,375 дюймов (9,5 мм) и настройкой энергии на 60 делений).

3. Денатурируют ДНК и гидролизуют примесь РНК, добавляя 5 н. NaOH до конечной концентрации 0,25 н. Нагревают до 50 °С в течение 15 мин, охлаждают и нейтрализуют эквивалентным количеством НС1.

4. Проводят диализ препаратов против буферного раствора 0,02 М NaCI+ 10"3 М HEPES, рН 7,0, и доводят концентрацию ДНК до 0,6 мг/мл.

Меченая ДНК. Для реализации обеих методик требуется небольшое количество денатурированной меченой ДНК с высокой удельной радиоактивностью и большой избыток денатурированной немеченой ДНК-Удельная активность должна составлять от 0,5 • 105 до 2,5 • 105 имп/мин «мкг, а концентрация ДНК<5 мкг/мл.

Титрование нуклеазы SJ. Ферментативную активность исходной нуклеазы SI (Calbiochem-Behring, La Jolla, Calif.) определяют следующим образом.

1. Препарат фрагментированной денатурированной бактериальной 3Н-ДНК в концентрации 0,6 мкг/мл, растворенный в буферном растворе 0,02 М NaCl-НмМ HEPES, рН 7,0, вносят по 50 мкл в несколько полипропиленовых пробирок (12X75 мм), содержащих по 1 мл буфера (0,05 М ацетат натрия +0,3 М NaCI + 0,5 мМ ZnCl2, рН 4,6; модификация буфера А Фогта [57]).

2. Добавляют по 50 мкл двойных разведений нуклеазы S1. Для разведения используют буфер 0,02 М

NaCl -f 1 мМ HEPES, рН 7,0. Пробирки инкубируют в течение 1 ч при 50 °С.

3. Добавляют 30 мкг фрагментированной нативной ДНК из спермы лосося (50 мкл при концентрации 0,6 мг/мл), осаждают ТХУ (конечная концентрация 5%), осадок собирают на нитроцеллюлозном фильтре и измеряют радиоактивность.

Измеряют степень гомологии, используя разведение фермента с концентрацией, в два раза превышающей концентрацию, которая необходима для полного гидролиза 30 мкг ДНК. Исходный препарат фермента разбавляют таким образом, чтобы его хватило для осуществления одного опыта. Исходную нуклеазу S1 титруют каждые 6 мес и хранят при —20 °С.

Смесь для реассоциации. В начале эксперимента нагревают нужное количество меченой ДНК в кипящей водяной бане в течение 5 мин, а затем охлаждают льдом. Дают возможность препарату нагреться до комнатной температуры и разливают порциями по 10 мкл. При этом температуру поддерживают постоянной, для того чтобы избежать колебания объема проб. Реакционную смесь, состав которой приведен ниже, разносят по пробиркам (6X22 мм).

Меченая ДНК 10 мкл

Буферный раствор 0,88 М NaCl-НО"3 М HEPES, 50 мкл

рН 7,0

Конкурентная ДНК, 0,6 мг/мл (яли нативная ДНК 50 мкл

лосося, 0,6 мг/мл)

Общий объем НО мкл

В две контрольные пробирки вносят фрагментиро-ванную нативную ДНК из спермы лосося (не имеющую гомологии с бактериальной ДНК) для измерения степени саморенатурации меченых фрагментов. Четыре пробирки используют для гомологичной реассоциации и две — для каждого из препаратов гетерологичных ДНК. Пробирки инкубируют в течение 20—24 ч при температуре на 25 °С ниже Тт ДНК-стандарта (Тт определена в буфере SSC). После инкубации из каждой проби