Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 3

Автор Ф.Герхардт

ледующим образом:

[1/(1 -г-^С00 30'45, (4)

где S — концентрация ДНК, чувствительной к нуклеазе S1 [54]. Уравнение (4) можно преобразовать:

[5/С0]2'222 = 1/(1 +^С00- (5)

Если на графике откладывают результаты, полученные с применением нуклеазы S1 по уравнению (5), то получают кривую Cot, сравнимую с кривой, получаемой при использовании гидроксилапатита. Важно также помнить, что на скорость реассоциации сильно влияет ионная сила, поэтому сравнивать результаты можно лишь при одинаковой ионной силе растворов.

Дополнительная информация, касающаяся кинетики реассоциации и кривых Cot, содержится в работах [1, 12, 19, 51, 59].

22.6.5. Мембранные методы

Мембранный метод определения гомологии ДНК отличается от метода реассоциации в растворе тем, что немеченая ДНК иммобилизуется на нитроцеллюлозном фильтре. Общая схема этого метода приведена на рис. 22.10.

Предварительные процедуры

Иммобилизацию ДНК на нитроцеллюлозных мембранных фильтрах и приготовление конкурентной ДНК можно провести за несколько месяцев до эксперимента, в то время как предынкубация мембраны является частью самого эксперимента.

Приготовление конкурентной ДНК

1. Препарат ДНК (2 мг/мл в буфере 0,1 X SSC или '0,02 М NaCl+ 10~3 М HEPES, рН 7,0) дважды пропускают через пресс Френча (11,2-107 Па) или обрабатывают ультразвуком (разд. 22.6.4 «Предварительные процедуры»).

МЕТОД ПРЯМОГО СВЯЗЫВАНИЯ МЕТОД, ОСНОВАННЫЙ НА

КОНКУРЕНЦИИ

Проба, содержащая одноцепочеч- Проба, содержащая одноц&почвчную меченую ДНК меченую ДНК

Большое количество одтцепочеч-ной конкурентной ДНК

Связывание с мембранным фильтром> содержащим одноцепочечную ДНК (немеченую)

Инкубация \

Отмывка мембранного аэильтра (двух цепочечные комплексы ДНК остаются связанными с ним)

Высушивание мембранного аэильтра и измерение радиоактивности

Рис. 22.10. Схема методов изучения гомологии ДНК с помощыа прямого связывания и конкуренции.

2. ДНК денатурируют нагреванием в кипящей бане-в течение 5 мин, после чего раствор ДНК быстро охлаждают, помещая пробирку в лед.

3. Денатурированную ДНК диализуют до равновесного состояния против охлажденного буфера 2,2 X SSC.

4. Доводят концентрацию ДНК до 1,5 мг/мл, добавляя буфер 2,2 X SSC.

Если препараты ДНК имеют значительные примеси РНК или отличаются высоким мол. процентом (G + C), их денатурируют с помощью NaOH (разд. 22.6.4 «Предварительные процедуры»).

Иммобилизация ДНК на мембране. Ниже приводится методика Джиллеспи и Спигелмана [28], адаптированная применительно к нитроцеллюлозному мембранному фильтру ВА 85 диаметром 15 см (Schleicher and Schu-ell Co., Keene, N. H.) с рабочей фильтрующей поверхностью около 173 см2. При иммобилизации 4,35 мг ДНК на каждый квадратный сантиметр приходится 25 мкг ДНК- Если размер мембраны меньше, соответственно изменяют количества ДНК и буфера.

1. 4,35 мг ДНК разбавляют буфером 0,1 X SSC (^90 мл) до концентрации 50 мкг/мл.

2. ДНК денатурируют, нагревая раствор (в 125-мл колбе Эрленмейера) в кипящей бане в течение 10 мин, затем быстро охлаждают его, вливая в 800 мл буфера 6 X SSC, охлажденного во льду (для получения концентрации ДНК около 5 мкг/мл).

3. Нитроцеллюлозный фильтр диаметром 15 см медленно кладут на поверхность дистиллированной воды таким образом, чтобы его поры заполнились водой (если мембрану погрузить сразу, образуются воздушные пузыри, которые препятствуют равномерной фильтрации).

4. Мокрый мембранный фильтр кладут на держатель (разд. 22.6.1) и промывают мембрану 500 мл холодного буфера 6 X SSC при скорости потока — 30 мл/мин. Затем денатурированную ДНК пропускают через фильтр и снова промывают 500 мл буфера 6 X SSC.

5. Мембрану высушивают при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 60 °С.

6. На краю мембраны делают пометку карандашом, разрезают фильтр на 2 половины, отделяют одну от другой половиной кусочка бумаги, которой мембраны были переложены в упаковочной коробке, и помещают их в конверт. Хранят в эксикаторе над CaSC>4 при комнатной температуре.

Мембраны берут за внешний край, избегая касания к той поверхности, на которой находится ДНК. Из большого мембранного фильтра вырезают маленькие диски в основном на центральных участках.

Пред инкубация мембран, содержащих ДНК

Смесь Денхардта для предынкубации [21] содержит следующие компоненты, растворенные в буфере 2 X SSC:

Бычий сывороточный альбумин (фракция V, Sigma 0,02%

Chemical Co., St. Louis, Mo.) Поливинилпирролидон (Calbiochem-Behring, La Jolla, 0,02%

Calif.)

Фикол 400 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, 0,02% Sweden)

1. Из мембраны диаметром 15 см вырезают пробойником мембраны размером 3x9 мм (разд. 22.6.1).

2. Мембраны предынку-бируют в течение 0,5—2 ч при температуре, используемой в эксперименте. В процессе инкубации мембраны несколько раз встряхивают.

3. Мембраны выкладывают на бумажное полотенце для удаления избыточной жидкости, а затем вносят их в реакционные смеси.

Рис 22.11. Флакон для определения радиоактивности на мембранных фильтрах.

1 — булавка;

2 — смесь на основе толуола;

<3 — фильтры, насаженные НА булавку.

Метод прямого связывания

С помощью метода прямого связывания количественно определяют способность меченой ДНК образовывать двухцепочечные комплексы с цепями ДНК, иммобилизованной на мембранных фильтрах. Для обеспечения значительной степени реассоциации с иммобилизованной ДНК необходимы большие, чем в случае метода реассоциации в растворе, количества меченой ДНК- Поэтому обычно используют препараты ДНК с низкой удельной активностью (2 000—10000 имп/минХ Хмкг). Реакционные смеси содержат:

Меченую ДНК (50—100 мкг/мл) 10 мкл

Буфер 2,2XSSC 100 мкл

1. Предынкубируют необходимое количество мембранных фильтров, содержащих ДНК, и хранят мембраны разных типов отдельно.

2. Готовят реакционные смеси и перемешивают их с помощью встряхивателя Vortex.

3. Мембраны помещают в пробирки, закрывают их пробками и инкубируют при температуре на 25 °С ниже Тт меченой ДНК (определенной в буфере SSC). Инкубация продолжается 12—15 ч.

4. Мембраны извлекают из пробирок и помещают в промывную камеру (рис. 22.4, В и 22.5). Промывают дважды по 5 мин в двух объемах (300 мл) буфера 2 X SSC при температуре инкубации. Во время промывания камеру периодически двигают взад и вперед для обеспечения протока буфера между ячейками. Мембранные фильтры вынимают и сушат на бумажном полотенце под лампой накаливания.

5. Мембраны насаживают на булавку, как показано на рис. 22.11.

6. Булавки с мембранами вносят в сцинтилляцион-ные флаконы (рис. 22.11) и измеряют радиоактивность.

Поскольку мембранные фильтры с ДНК отличаются друг от друга, прямые измерения не обеспечивают высокой точности. Так же как в методике с нуклеазой S1 (табл. 22.2), число импульсов для мембраны с гетеро-логичной ДНК делят на число импульсов для мембраны с гомологичной ДНК. Умножив это отношение на 100, получают процент гомологии.

Методика определения термостабильности

1. Проводят процедуру прямого связывания ДНК, включая промывание (п. 4).

2. Извлекают мембранные фильтры из камеры для промывания и насаживают их на булавку ближе к головке. Булавку вкалывают в резиновую пробку (рис. 22.7), закрывающую трубку и помещают в первую пробирку для элюирования. Если фильтров несколько, их отделяют друг от друга тефлоновыми дисками.

3. Пробирки для элюирования размером 13x100 мм, содержащие 1,2 мл буфера 0,5 X SSC, ставят в водяную баню и проводят постепенное элюирование двухцепочечных комплексов, увеличивая температуру бани на 5°С через каждые 10 мин. В конце каждого 10-мин периода фильтры переносят в другую пробирку для элюирования и шовышают температуру на 5°С. Профиль элюирования начинают определять при температуре приблизительно на 10 °С ниже температуры, при которой осуществлялось прямое связывание. Устанавливают 9 разных температур элюирования и определяют радиоактивность на фильтрах (т. е. 10 сцинтилляционных флаконов на каждую кривую термостабильности).

4. Сливают содержимое каждой пробирки для элюи-рования в сцинтилляционный флакон и промывают пробирку 0,5 мл буфера 0,5 X SSC, сливая раствор после промывания в сцинтилляционный флакон.

5. Добавляют 10 мл сцинтилляционного раствора с тритоном Х-100 (3 части сцинтилляционного раствора толуола и 2 части сцинтилляционного раствора с тритоном Х-100) в каждый флакон, перемешивают и измеряют радиоактивность.

Интегральные кривые элюирования получают, суммируя значения радиоактивности при каждой температуре-и разделив результат на общую радиоактивность (т. е. подсчитывают среднее значение для 10 образцов). Хотя эти кривые обратны по отношению к кривым, полученным методом реассоциации в растворе, значения Тт^у могут быть определены тем же способом.

Для определения профиля термостабильности с помощью автоматической пипетки заливают по 1,2 мл буфера 0,5 X SSC одновременно во все пробирки Вассер-мана. Одну пробирку для элюирования ставят в водяную баню раньше других для предварительного нагревания. В дополнительную пробирку помещают термометр и отмечают точную температуру в середине и в конце каждого температурного интервала.

Методика, основанная на конкуренции

В этой методике используют фрагменты немеченой денатурированной ДНК, конкурирующие с денатурированной меченой ДНК при образовании двухцепочечных комплексов ДНК, связанных с мембранным фильтром. Препарат- конкурент содержит 1,5 мг/мл ДНК в буфере 2,2 X SSC; его добавляют в реакционную смесь в количестве 75 или 150 мкг. Объемы различных реакционных смесей указаны в табл. 22.4. Данная методика сходна с процедурой прямого связывания, за исключением того, что во всех реакционных пробах используется один и тот же вид фильтра с ДНК, а вид и количество конкурентной ДНК различны. Для каждого объема конкурентной ДНК используют две пробирки и ставят б проб без конкурентной ДНК в нулевой точке.

Для определения процента гомологии величину подавления связывания за счет фрагментов гетерологичТаблица 22.5. Гипотетический пример расчетов процентов гомологии ДНК в процедуре оп

страница 26
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 3" (2.64Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.10.2019)