Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 3

Автор Ф.Герхардт

ределения конкуренции при использовании

мембранного метода

Имп/мин Подавление, имп/мин Гомология, %

Прямое связывание без кон- 1000 .

курента 880

Гомологичный конкурент 120

100

(75 мкг)

Гомологичный конкурент 90 910 100

(150 мкг)

Гетерологичиый конкурент 400 600 (600/880)-100 = 68

(75 мкг)

Гетерологичиый конкурент 380 620 (620/910) -100 = 68

(150 мкг)

ной немеченой ДНК делят на величину подавления за счет фрагментов гомологичной немеченой ДНК при каждой концентрации конкурента и результат умножают на 100. Пример подобных расчетов приведен в табл. 22.5.

22.7. ГОМОЛОГИЯ РНК

Методика определения гомологии рРНК отличается от методик определения гомологии ДНК, так как с РНК комплементарно взаимодействует только небольшая фракция (0,1—0,3%) всей ДНК. Поскольку РНК комплементарна лишь одной из цепей ДНК, молекулы РНК не связываются комплементарно друг с другом. Главным требованием при проведении опытов с РНК является отсутствие РНКазы на фильтрах и стеклянной посуде. В данном разделе описаны методики прямого измерения связывания меченой РНК с ДНК, иммобилизованной на мембранных фильтрах, или непрямого определения конкуренции при связывании. Дополнительная информация по методикам и интерпретации результатов содержится в работах [9—11, 20, 26, 28, 29, 36].

22.7.1. Предварительные процедуры

Как и при определении гомологии ДНК мембранным методом, перед использованием аналогичного метода для РНК проводят ряд подготовительных процедур.

Очистка стеклянной посуды и буферов от РНКазы [22]

Всю стеклянную посуду прокаливают в муфельной печи или в печи для стерилизации сухим жаром. Пластмассовую посуду автоклавируют, погружая ее в 0,1%-ный детергент (например, изоклин, Isolabs Co., Akron, Ohio). Все буферы автоклавируют и обрабатывают 0,2%-ным диэтилпирокарбонатом (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.).

Приготовление меченой РНК

Методика введения метки в рРНК очень похожа на аналогичную процедуру для ДНК (разд. 22.6.2). В качестве предшественников при включении метки в РНК in vivo используют обычно 14С- или 3Н-урацил или ури-дин или Н332Р04. В течение последних 30 мин инкубационного периода часто создают большой (100-кратный) избыток немеченого предшественника для снижения удельной активности мРНК. Меченую РНК выделяют так же, как немеченую (разд. 22.3). Ь молекулы РНК можно также ввести in vitro l25I (разд. 22.6.3).

Фракционирование РНК

Поскольку существует несколько классов РНК, меченую (ые) РНК, предназначенную для экспериментов по гибридизации, обычно отделяют от остальных. Хотя можно выделить рибосомы, разделить их на субчастицы и затем выделить из них рРНК, обычно фракционируют суммарную РНК и разделяют РНК разных типов методом электрофореза в полиакриламидном геле [8, 24, 40, 53] или центрифугированием в градиенте сахарозы [46]. 23S-pPHK фракционируют центрифугированием в градиенте сахарозы 5—20%, приготовленном в буфере 1 X SSC. Фракционирование 16S-pPHK может осложняться за счет соосаждения продуктов деградации 23 S-pPHK.

Конкурентная РНК

Исходные препараты РНК разбавляют до концентрации 1 мг/мл буфером 0,1 X SSC + Ю"3 М HEPES, рН 7,0. Пробы нагревают в течение 5 мин в кипящей водяной бане, быстро охлаждают во льду и хранят при —80 °С.

Иммобилизация ДНК и предынкубация мембран,

содержащих ДНК

ДНК иммобилизуют на нитроцеллюлозных мембранных фильтрах, как описано в разд. 22.6.5 «Предварительные процедуры». Используют автоклавирование и обработку буферов диэтилпирокарбонатом; если препараты ДНК содержат примеси РНКазы, то их обрабатывают перед денатурацией диэтилпирокарбонатом или протеолитическими ферментами. Продолговатые фильтры размером 3x9 мм или круглые с диаметром 10 мм ?предынкубируют в смеси Денхардта. Используют буферы, не содержащие РНКазу.

Недавно были иммобилизованы фрагменты или молекулы ДНК и РНК путем их ковалентного присоеди^ нения к диазобензилоксиметилированной бумаге [7Т 55]. Иммобилизованная таким способом ДНК может быть очень полезна в экспериментах, основанных на сравнении термостабильности. Эту бумагу можно приобрести у двух фирм (Enzobond, Enzo Biochemicals, Inc., New York, N. Y., Schleicher and Schuel Co.r Keene, N. H.).

Инструкции по использованию бумаги высылаются обеими фирмами.

Применение формамида

Формамид является лучшим растворителем для снижения температур денатурации двухцепочечных комплексов ДНК и гибридов РНК — ДНК. При более низких температурах денатурации снижается степень термической деградации нуклеиновых кислот. В буферах, содержащих от 0,035 до 0,88 М NaCl, на каждый процент формамида Тт ДНК снижается на 0,60 °С [34]. Для гибридизации рРНК на фильтре Джиллеспи и Джиллес-пи [29] применяли 50%-ный формамид в буфере 6 X SSC при температуре инкубации 38 °С, а Де Лей и Де Смедт [20] использовали 20%-ный формамид в буфере 2 X SSC и при температуре инкубации 50°С.

Для экспериментов по гибридизации с использованием 20%-ного формамида готовят буфер 5,5XSSC+ + 10-3 М HEPES (табл. 22.6), содержащий 55% формамида, а также буфер 3,5XSSC+10~3 М HEPES (табл. 22.6), содержащий 35% формамида. Для опытов с использованием 50%-ного формамида готовят буфер 3,5XSSC+10~3 М HEPES, содержащий 87,5% формамида.

22.7.2. Мембранный метод

Методика прямого связывания

Поскольку лишь небольшая часть ДНК комплементарна РНК, в зависимости от удельной активности препарата рРНК для эксперимента могут потребоваться ДНК-содержащие мембраны разного диаметра (например, до 10 мм).

1. Прямое связывание РНК с использованием небольших продолговатых мембран 3X9 мм проводят согласно методике для прямого связывания ДНК- В одну пробирку вносят 0,5 мкл меченой РНК. Мембраны отмывают так же, как в случае с ДНК- Для отделения неспаренных фрагментов рРНК от гибридов камеру для промывания помещают в раствор панкреатической РНКазы (25 мкг/мл в буфере 2 X SSC) и инкубируют 30 мин при 37°С. После инкубации мембраны еще раз промывают. Измерив радиоактивность на мембране, определяют количество содержащейся на ней ДНК

Продолжение

Добавляемый компонент Количество конкуренткой РНК при диаметре фильтров 10 мм

0 50 мкг 100 мкг

Меченая рРНК (25 мкг/мл) Конкурентная рРНК (1 мг/мл) Буфер 0,lXSSC+10-3 м HEPES Буфер 5,5XSSC+10~3 М HEPES Буфер 3,5XSSC+10-3 М HEPES Общий объем 50 МКЛ

100 МКЛ

200 мкл 350 мкл 50 мкл 50 мкл 50 мкл

200 мкл 350 мкл 50 мкл 100 мкл

200 мкл 350 мкл

(разд. 22.4.3). Если известна удельная активность РНК, то в импульсах в минуту или в микрограммах определяют связанную РНК, приходящуюся на 1 мкг ДНК2. Фильтры диаметром 10 мм делают с помощью дырокола для бумаги с одним отверстием, убедившись, что он хорошо очищен от смазочного масла. Инкубируют в 4-мл пробирках (Weaton Scientific, Millville, N. J.) в реакционной смеси объемом 0,35 мл. В каждую пробирку вносят 1—2 мкг меченой рРНК.

3. Термостабильность гибридов определяют так же, как и в случае с двухцепочечными комплексами ДНК (разд. 22.6.5).

Методика, основанная на конкуренции

Используют различные реакционные смеси в зависимости от размера мембран (табл. 22.6). Дополнительные сведения по этому вопросу содержатся в работе [36].

Пробирки с реакционной смесью инкубируют в течеНИЕ НОЧИ ПРИ 65 °С, ПОСЛЕ ЧЕГО МЕМБРАНЫ ОТМЫВАЮТ ГАК ЖЕ, КАК В МЕТОДИКЕ ПРЯМОГО СВЯЗЫВАНИЯ. МРЖНА ОБРАБАТЫВАТЬ МЕМБРАНЫ РНКВЗОЙ, ХОТЯ ЭТО ПОЧТИ НЕ ВЛИЯЕТ НА РЕЗУЛЬТАТ. ЗАТЕМ ОПРЕДЕЛЯЮТ КОЛИЧЕСТВО ДНК НА МЕМБРАНАХ. РАСЧЕТЫ ПРОВОДЯТ ТАК ЖЕ, КАК В ЭКСПЕРИМЕНТАХ ПО ИЗУЧЕНИЮ ГОМОЛОГИИ ДНК С ТОЙ РАЗНИЦЕЙ, ЧТО РЕЗУЛЬТАТ ВЫРАЖАЮТ В ИМП/МИН*МКГ ДНК, СВЯЗАННОЙ С МЕМБРАНОЙ.

22.8. ЛИТЕРАТУРА

22.8.1. Общая литература

1. Britten R. L, Graham D. Е., Neufeld В. R. Analysis of repeating

DNA sequences by reassociation, Methods Enzymol., 24 E, 363—

406 (1974).

Несмотря на то что эта работа касается в основном ДНК эука-риот с повторяющимися последовательностями, она содержит много практической информации, которую можно использовать при работе с ДНК бактерий (прокариот).

2. Kennell D. Е. Principles and practices of nucleic acid hybridization, Prog. Nucleic Acid Res. Mol, Biol., 11, 259—301 (1971). Обзорная статья, посвященная гибридизации различных видов РНК с помощью мембранных методов.

3. McCarthy В. J., Church R. В. The specificity of molecular hybridization reactions, Annu. Rev. Biochem., 39, 131—150 (1970). Статья помогает понять принципы реакций гибридизации ДНК и РНК (гомологии).

4. Moore R. L. Nucleic acid reassociation as a guide to genetic rela-tedness among bacteria, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 64, 105— 128 (1974).

Обзорная статья no использованию сходства нуклеиновых кислот В таксономии бактерий.

5. Parish /. Я. Principles and practice of experiments with nucleic

acids, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1972.

Книга содержит общую н специальную информацию, касающуюся широкого круга экспериментов.

6. Wetmur J G. Hybridization and renaturation kinetics of nucleic

acids, Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 5, 337—361 (1976).

Обзор посвящен в основном кинетике реассоциации в свободном растворе.

22.8.2. СПЕЦИАЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА

7. Alwine J. С, Kemp P. J.t Stark G. R. Proc. Nafl. Acad. Sci. U.S A „ 74, 5350—5354 (1977).

8. Bishop D. H. L., Claybrook J. R.t Spiegelman S. J. Mol. Biol., 2fc, 373—387 (1967).

Э. Bishop Л О. Nature (London), 224, 600—603 (1969). 10. Bishop Л О. Biochem. J., 116, 223—228 (1970). И. Brenner D. J., Fanning G. /?., Rake A. V., Johnson E. K. Anal. Biochem., 28, 447—459 (1969).

12. Britten R. J., Kohne D. E. Science, 161, 529—540 (1968).

13. Britten R. J., Pavich М.к Smith J. Carnegie Inst. Washington Yearb., 68, 400—402 (1969).

14. Cashion P., Holder-Franklin M. A., McCully J., Franklin M. Anal. Biochem., 81, 461—466 (1977).

15. Chelm B. K.t Hallick R. B. Biochemistry, 15, 593—599 (1976).

16. Cotnmerford S. L., Biochemistry, 10, 1993—2000 (1971).

17. Crosa J. H, Brenner D. J, Falkow S. J. Bacteriol., 115, 904—911 (1973).

18. De Ley J J. Ba-teriol., 101, 738—754 (1970).

19. De Ley J., Cattoir

страница 27
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 3" (2.64Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.11.2019)