H., Reynaerts A. Eur. J. Biochem., 12, 133—142 (1970).

20. De Ley J., De Smedt J. Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol. Serol., 41, 287—307 (1975).

21. Denhardt D. T. Biochem. Biophys. Res. Commun., 5, 641—646 (1966).

22. Ehrenberg L., Fedorcsak I. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol, 16, 189—262 (1976).

23. Ferragut C., Leclerc H. Ann. Microbiol. (Parts), 127A, 223—235 (1976).

24. Franklin R. M. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 55, 1504—1511 (1966).

25. Fredericq E., Oth A., Fontaine F. J. Mol. BioL, 3, 11—17 (1961).

26. Galau G. A., Britten R. L, Davidson E. H. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 1020—1023 (1977).

27. Giles K. W., Meyers A. Nature (London), 206, 93.

28. Gillespie D.t Spiegelman S. J. Mol Biol, 12, 829—842 (1965).

29. Gillespie S., Gillespie D. Biochem. J, 125, 481—487 (1971).

30. Grossman L., Moldave K. (ed.). Methods Enzymol., 12B, 87—160 (1968).

31. Hayes D. H., Gros F. Methods Enzymol, 12B, 771 (1968).

32. Hontebeyrie M., Gasser F. Int. J. Syst. Bacteriol., 27, 9—14 (1977).

33. Huang P. C, Rosenberg E. Anal. Biochem., 16, 107—113 (1966).

34. Hutton J. R. Nucleic Acids Res., 4, 3537—3555 (1977).

35. Johnson J. L. Int. J. Syst. Bacteriol., 28, 245—256 (1978).

36. Johnson J L., Francis B. S. J. Gen. Microbiol., 88, 229—244 (1975).

37. Kelly R. B.f Cozzarelli N. R., Murray M. P., Deutscher P., Lehman 1. R.f Kornberg A. J. Biol. Chem., 245, 39—45 (1970).

38. Kirby К S. Methods Enzymol., 12B, 87—99 (1968).

39. Ко С. Y., Johnson /. L., Barnett L. B, McNai H. M., Vercellot-ti J. R. Anal. Biochem., 80, 183—192 (1977).

40. Loening U. E. Biochem. J., 102, 251—257 (1967).

41. Mandel M., Igambi L., Bergendahl J., Dodson M. L.t Jr., Schelt-gen E. J. Bacteriol., 101, 333—338 (1970).

42. Mandel M., Schildkraut C. L., Marmur J. Methods Enzymol., 12B, 184—195 (1968).

43. Markov G. G., Ivanov I. G. Anal. Biochem., 59, 555—563 (1974).

44. Marmur J. J. Mol. Biol., 3, 208—218 (196L).

45. Marmur J.t Doty P. J. Mol. Biol., 5, 109—118 (1962).

46. McConkey E. H. Methods Enzymol., 12A, 620—634 (1967).

47. Meinke W. D., Golstein D. V., Hall M. R. Anal. Biochem, 58, 82—88 (1974).

48. Nonoyama M., Pagano J. S. Nature (London), 242, 44—47 (1973).

49. Orosz J. M., Wetmur J. G. Biochemistry, 13, 5467—5473 (1974).

50. Rigby P. W. /., Dieckmann W., Rhodes C, Berg P. J. Mol. Biol.. 113, 237—251 (1977).

51. Seidler R. J., Mandel M.t J. Bacteriol, 106, 608—614 (1971).

52. Shaposhnikov J. D, Zerov Y. P., Ratovitski E. A, Ivanov S. D, Bobrov Y. V. Anal. Biochem., 75, 234—240 (1976).

53. Sogin M. L., Woese C. R„ Pace В., Pace N. R. J. Mol. Evol., 2, 167—174 (1973).

54. Smith M. J, Britten R. J., Davidson E. H. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 72, 4805—4809 (1975).

55. Stark G. R., Willams J. G. Nucleic Acids Res., 6, 195—203 (1979).

56. Tereba A., McCarthy В. J. Biochemistry, 12, 4675—4679 (1973).

57. Vogt V. M. Eur. J Biochem, 33, 192—200 (1973).

58. Wang S. Y., Hashagen J. M. J. Mol. Biol., 8, 333—340 (1964).

59. Wetmur /. G, Davidson N. J. Mol. Biol., 31, 349—370 (1968).

60. Yamada Komagata K. J. Gen. Appl. Microbiol., 16, 215—224 (1970).

Часть VI

ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ В ЛАБОРАТОРИИ

ВВЕДЕНИЕ

Г. Филлипс

Полное уничтожение бактерий путем стерилизации, меры по предотвращению заражения и дезинфекция представляют собой важные стороны лабораторной работы. Методы общей бактериологии, опирающиеся на морфологию, рост, генетику, обмен веществ и систематику бактерий, основаны на использовании чистых культур, поддержание которых зависит от предшествующей стерилизации и последующего предотвращения заражения другими бактериями, содержащимися в средах, емкостях и на инструментах. Кроме того, бактериологические методы основаны на ликвидации оставшихся бактерий, которые могут инфицировать другие культуры и, что еще важнее, людей. Двойная цель техники лабораторной безопасности заключается в защите как эксперимента, так и экспериментатора, но безопасность человека стоит, конечно, на первом месте.

Из того факта, что обычно используемые бактерии присутствуют в окружающей среде, как будто следует, что они безвредны для человека. Действительно, между непатогенностью и патогенностью нет резкой границы; фактически бактерии имеют широкий спектр степени вирулентности по отношению к человеку. Вчерашний сапрофит сегодня может стать паразитом, а завтра возбудителем заболевания (в качестве примеров можно назвать Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens и Bacillus ce-reus). Никогда нельзя забывать, что со всеми бактериями следует работать как с потенциальным источником опасности для здоровья человека.

В первой главе этого раздела описываются методы стерилизации материалов паром (влажным жаром),

сухим жаром, газами, облучением и фильтрацией. Вто* рая глава содержит методы физического предотвращения заражения и химической дезинфекции как в общих целях, так и для специальных лабораторных операций.

В настоящем руководстве при описании методов, в которых экспериментатор может подвергнуться опасным химическим или биологическим воздействиям, приведены соответствующие предупреждения. Правила радиоактивной безопасности представлены в разд. 16.4.1.

Глава 23

СТЕРИЛИЗАЦИЯ М. Коржинский

Цель процесса стерилизации состоит в удалении или уничтожении всех живых микроорганизмов внутри или на поверхности предмета. В микробиологических лабораториях для стерилизации культуральных сред, оборудования и стеклянной посуды используется пар, для стерилизации стеклянной посуды и металлического оборудования — сухой жар, для стерилизации инструментов— газ, для стерилизации растворов — фильтрация и в особых случаях применяют радиоактивное облучение. Стерилизация широко используется в больницах» фармакологии и на производстве. Изменения в службах охраны здоровья, в типах медицинской продукции, требующих стерилизации, а также государственные постановления влекут за собой изменения в технике осуществления стерилизации. Стерилизация характеризуется развивающейся технологией с непрерывным усовершенствованием в конструкциях оборудования и его управлении. Методы стерилизации описываются во многих работах общего характера [1—13].

Стерилизация есть вероятностная функция. Гибель клеток бактерий обычно описывается экспоненциальной кривой подобно химической реакции первого порядка (рис. 23.1). Эффективность стерилизации выражается в виде статистической вероятности выживания клеток [35]. По окончании процессов стерилизации (влажным жаром, сухим жаром, ионизирующим облучением и окисью этилена) вероятность выживания клетки должна составлять не более 10~6.

Любой метод стерилизации, за исключением фильтрации, можно охарактеризовать скоростью уничтожения живых микроорганизмов. Параметр D применяется для оценки стерилизации путем нагревания и представляет собой время, необходимое при данной температуре для лолучения десятикратного (90%-ного) уменьшения популяции микробов; температуру часто обозначают в нижнем индексе (например, Dm), Параметр D можно получить графически построением зависимости логарифма числа выживших бактерий от времени воздействия стерилизующего агента. При этом параметр D определяется как время на абсциссе, соответствующее десятикратному уменьшению числа бактерий по ординате (рис. 23.1). Этот параметр можно также вычислить [15]. Параметр z представляет собой изменение температуры в градусах по шкале Цельсия или Фаренгейта, которое требуется для изменения параметра D в 10 раз. Параметр F0 представляет собой значение инактивации бактерий под действием нагревания, вычисляемое делением необходимого времени при заданной температуре нагревания на эквивалентное время при 121 °С (250 °F), когда г равно 10°С (18°F).

Часто для определения числа выживших бактерий используют два метода, а именно: подсчет числа клеток, выживших после посева в чашки (по числу образовавшихся колоний), и оценка наиболее вероятного числа (НВЧ) выживших клеток с использованием флуктуа-ционного 1песта. Первый метод описан в разд. 11.2 этой книги. При его использовании строят график зависимости логарифма числа подсчитанных в чашках клеток от времени при данной температуре. По этим точкам проводят прямую (разд. 11.5.7) либо на глаз, либо с помощью метода наименьших квадратов (разд. 11.5.8) и определяют по ней параметр Z>. Процесс гибели клеток, как правило, подчиняется логарифмическому закону. Однако наблюдаются и отклонения от этого закона. В этих случаях вычисление параметра D не очень существенно. Отклонения могут объясняться такими факторами, как гетерогенность начальной популяции в отношении устойчивости, различное состояние клеток в условиях эксперимента (клетки, сбившиеся в комки), а также адаптация клеток в процессе нагревания [24].

Для определения числа бактерий, выживших при различных временах воздействия, и тем самым для получения параметра D [10, 13] можно также использовать флуктуационный тест. Эксперимент должен быть поставлен таким образом, чтобы во всех пробирках наблюдался рост при самом коротком времени экспозиции и рост отсутствовал бы во всех пробирках в случае наиболее продолжительной экспозиции. Промежуточные времена экспозиции следует выбирать так, чтобы рост имел место в определенной части пробирок. Рекомендуется использовать как минимум три разные температуры. Уравнение для вычисления числа выживших бактерий в пробе имеет вид

В = In/7? = 2,303 lg (r/fl,

где В— вероятное число выживших бактерий, г—число проб, исследуемых за временной интервал, и q — число стерильных проб [23].

Для стерилизации в промышленных условиях применяют общепринятые способы, но необходимо провести контрольные исследования, используя микроорганизмы с заранее известной устойчивостью; в большинстве случаев это бактериальные споры. Необходимо также периодически проверять суспензию спор на сохранение устойчивости. При установлении режима стерилизаций следует использовать по крайней мере три параллельные пробы для каждого времени воздействия и дл