). Диск помещают на поверхность инокулированного кровяного агара (разд. 20.3.7) и инкубируют в течение 24 ч. Положительная реакция: образование вокруг дисков зоны инги-бированного роста.

Примеры: положительный результат — Streptococcus pyogenes; отрицательный — другие р-гемолитические стрептококки.

20.1.9. Растворение клеток в желчи

Центрифугируют 24-ч культуру, выращенную в 10 мл бульона Тодда — Хевитта (разд. 20.3.33), и надосадоч-ную жидкость переносят в колбу с дезинфицирующим веществом. Клетки суспендируют в 0,5 мл 0,067 М фосфатного буфера, рН 7,0 (разд. 20.4.16). Добавляют 0,5 мл 10%-ного дезоксихолата натрия и инкубируют при 37°С в течение 15—30 мин. Положительная реакция: суспензия становится прозрачной. Примеры: положительный результат — Streptococcus pneumoniae; отрицательный — другие а-гемолитические стрептококки.

20.1.10. Устойчивость к желчи

Метод 1. Посев проводят штрихом на желчный агар (разд. 20.3.6) в чашках. Сравнивают рост на среде с желчью с ростом на среде без желчи. Примеры: положительный результат (10 и 40% желчи)—Streptococcus faecalis; положительный результат (10, но не 40% желчи) — Streptococcus salivarius; отрицательный результат (ни 10, ни 40% желчи)—Streptococcus dysgatactiae.

Метод 2. Этот метод используют для анаэробов [7]. Инокулируют пептонно-дрожжевой бульон (разд. 20.3.28), содержащий 2% бычьей желчи и 1% глюкозы, с помощью пастеровской пипетки, пропуская через бульон очищенную от кислорода двуокись углерода. Закрывают пробирки пробками и инкубируют. Наблюдают за ростом и сравнивают его с ростом на среде, не содержащей бычьей желчи.

Примеры: рост — Bacteroides oralis; отсутствие роста — Bacteroides melaninogenicus.

20J.11. Гидролиз казеина

Стерильное (автоклавированное) снятое молоко смешивают при 50 °С с равным объемом питательного агара двойной концентрации (разд. 20.3.25) или другой не содержащей углеводов агаровой среды при 50—55 °С. Чашки с инокулированной штрихом средой инкубируют до 14 дней и проверяют, не образуются ли просветления вокруг зон роста. Результат проверяют с помощью заливки среды 10%-ной HCI. Примечание: образование кислоты из лактозы может подавлять гидролиз казеина, поэтому необходимо предварительно диализовать снятое молоко. Примеры: положительный результат—Bacillus polymyxa; отрицательный — Bacillus macerans.

20.1.12. Тест на каталазу

Метод 1. Посев производят в пробирках на скошенный питательный агар (разд. 20.3.25) или другую среду, не содержащую крови. После инкубации вливают по капле вниз по косяку 1 мл 3%-ной перекиси водорода. Сразу же и через 5 мин наблюдают за образованием пузырьков, которое означает положительную реакцию. Параллельно добавляют несколько капель 3%-ной перекиси водорода к колониям на чашке или к зонам обильного роста, который может наблюдаться на поверхности полужидкой среды или около нее. В случае бульонной культуры к 0,5 мл культуры добавляют 0,5 мл 3%-ной перекиси водорода и наблюдают за постоянным образованием пузырьков. Примечание: не следует применять для теста на каталазу среду, содержащую кровь, так как кровь, если ее предварительно не прогреть, имеет каталазную активность (метод 3). Некоторые бактерии (например, молочнокислые) в средах с низкими концентрациями глюкозы или вообще без глюкозы образуют негемовую «псевдокаталазу» [94]. Образование псевдоката'лазы можно предотвратить введением в среду глюкозы (1%). При проверке анаэробов на каталазную активность важно перед добавлением перекиси водорода выдержать культуру на воздухе в течение 30 мин.

Примеры: положительный результат — Staphylococcus epidermidis; отрицательный — Streptococcus lactis.

Метод 2. Этот метод устраняет проблему впитывания, которая может возникать при добавлении перекиси водорода в колонии, растущие в чашках или на косяках. Выросшую культуру снимают с поверхности агара неметаллическим инструментом и суспендируют в капле 3%-ной перекиси водорода на предметном стекле. Немедленно и через 5 мин наблюдают за образованием пузырьков визуально или в микроскоп с малым увеличением.

Метод 3. Метод применяется для определенных бактерий, способных образовывать каталазу только при росте на среде, содержащей гем, например для некоторых молочнокислых бактерий [94]. К стерильной основе кровяного агара (разд. 20.3.31), содержащей 1% глюкозы для ингибирования образования псевдокаталазы, добавляют 5% (по объему) смеси дефибринированной крови (разд. 20.3.7) и стерильной воды (1:1). Среду нагревают при 100 °С в течение 15 мин для инактивации каталазы крови, охлаждают до 45—50 °С и разливают по чашкам. Рост проверяют непосредственно в чашках с помощью 3%-ной перекиси водорода или по методу 2.

20.1.13. Целлюлолитическая активность

Метод 1 [45]. Используемая в этом методе обработка целлюлозы обеспечивает наилучшее определение цел-люлолитической активности; другие обработки описаны в работах [12,13]. Хорошо измельченную целлюлозу вносят в соответствующую агаровую среду, не содержащую углеводов. Чтобы приготовить такую целлюлозу, производят мокрый размол (3%; вес/объем) фильтровальной бумаги Whatman №1 в барабанной мельнице. Помещают 30 г бумаги (разорванной на мелкие кусочки) в фарфоровый барабан (емкостью около 4 л), содержащий 1 л воды, вносят нужное количество кремневой гальки (фарфоровые шарики менее эффективны) так, чтобы вода лишь покрывала осадок; барабан вращается в течение суток со скоростью 74 об/мин до получения очень мелкодисперсной и вязкой суспензии. Вращение следует прекратить до того, как начнет снижаться вязкость и образуются вещества, восстанавливающие медь. [Тест на их наличие проводят с 1 мл суспензии, как описано в разд. 20.1.30, используя 1 мл реактива Бенедикта (разд. 20.4.1).] Положительная реакция: появление зон просветления вокруг колоний на целлюлозном агаре. Может потребоваться инкубация в течение длительного периода.

Примеры: положительный результат — виды Cellulo-monas; отрицательный — Escherichia coli.

Метод 2. Этот метод менее чувствителен, чем метод 1. Перед автоклавированшш полоску фильтровальной бумаги Whatman № 1 помещают в пробирку с бульоном, не содержащим углеводов. Часть полоски должна выступать выше уровня бульона. Положительная реакция: частичное или полное разрушение полоски бумаги в процессе роста культуры.

20.1.14. Потребление цитрата

Метод 1. Готовят разбавленную суспензию микроорганизмов в стерильной воде или физиологическом растворе. Посевной материал наносят штрихом на косяк нитратного агара Симмонса (разд. 20.3.30). Инкубируют 7 дней. Положительная реакция: появление голубой окраски, означающей использование цитрата в качестве единственного источника углерода.

Примеры: положительный результат — Enterobacter aerogenes; отрицательный — Escherichia coil.

Метод 2. Разбавленную суспензию клеток наносят штрихом на всю поверхность косяка нитратного агара Кристенсена (разд. 20.3.11). Инкубируют 7 дней. Положительная реакция: появление красной окраски или окраски цвета фуксина. Примечание: положительная реакция означает использование цитрата, но не обязательно в качестве единственного источника углерода, т. е. организм может давать положительную реакцию на агаре Кристенсена и отрицательную — на нитратном агаре Симмонса.

20.1.15. Коагулаза

Одну полную петлю бактериальной массы, снятой со скошенного агара, 0,1 мл бульонной культуры или одну колонию, снятую с агара в чашке, смешивают с 0,5 мл неразведенной плазмы крови кролика или плазмы, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1 :4. Инкубируют при 37 °С и наблюдают через 4 и 24 ч. Положительная реакция: образование плотного или рыхлого сгустка, суспендированного в плазме. Гранулированные или вязкие образования нельзя считать положительным результатом.

Примеры: положительный результат — Staphylococcus aureus; отрицательный — Staphylococcus epidermi-dis.

20.1.16. Кокковидные тела

Культуры, поддерживаемые в статическом состоянии (не встряхивавшиеся во время роста) в течение 4 нед, изучают методом фазово-контрастной микроскопии. Кокковидные тела могут обнаруживаться уже на 2-й или 3-й день. Положительная реакция: преобладание круглых преломляющих свет форм с диаметром, превышающим диаметр исходных клеток, и не имеющих утолщенной стенки. Многие формы имеют дискретные темные периферийные участки цитоплазмы, в других случаях клетки выглядят пустыми. Кокковидные тела встречаются у некоторых спирилл, вибрионов и кампилобакте-ров.

Примеры: положительный результат — Aquaspiril-lum itersonii; отрицательный — Aquasplrillum serpens.

20.1.17. Колонии

Измеряют диаметр колоний в миллиметрах, описывают их пигментацию, форму, высоту и вид края, как показано на рис 20.1. Для рассмотрения краев может потребоваться микроскоп с малым увеличением. Следует описать также поверхность колоний, которая бывает гладкой (блестящей, сверкающей), шероховатой (тусклой, неровной, гранулированной, матовой), мукоидной (слизистой или клейкой на вид). Отмечают степень прозрачности колоний (прозрачные, полупрозрачные или непрозрачные) и их консистенцию при проверке иглой: маслянистую (маслоподобную), вязкую (клейкую) или сухую (хрупкую или порошкообразную). Описывают колонии как молодых, так и старых культур. На характеристики колонии могут влиять среда, возраст культуры, газовый состав среды, степень освещенности и другие условия культивирования.

20.1.18. Цисты и микроцисты

Культуры ежедневно просматривают с помощью фазово-контрастной микроскопии. С возрастом палочковидные клетки приобретают сферическую форму, а стенки клеток утолщаются. Сферические формы могут быть оптически плотными или светопреломляющими. Они не

Точечная Круглая Волокнистая Неправильная Ризоидная

Веретенообразная

ПРОФИЛЬ

Плоский

Высокий

Выпуклый

Подушечко-офазный

ПупоЬидныи

Гладкий Волнистый Лопастной Зубчатый Волокнистый Складчатые

Рис. 20.1. Различные формы, профили и края колоний бактерий. (Приводится в измененном виде из работы [74] с разрешения McGraw-Hill Book Co.)

обладают устойчивостью эндоспор к нагреванию (разд. 20.1.52), за иск