еза. Примеры: положительный результат — Streptococcus agalac-tiae\ отрицательный — Streptococcus pyogenes.

Метод 2 [46]. Этот метод позволяет более быстро проводить определение гидролиза гиппурата. Готовят 1%-ный раствор гиппурата натрия в дистиллированной воде и разливают в пробирки по 0,4 мл. Пробирки, закрытые пробками, хранят в морозильнике при —20 °С. Перед экспериментом содержимое пробирок размораживают и смешивают с ним до получения очень густой суспензии полную петлю выросшей культуры, взятой с поверхности твердой среды. Пробирку инкубируют в блочном термостате или в водяной бане при 37 °С в течение 2 ч. После инкубации добавляют приблизительно ?,2 мл нингидринового реактива [3,5 г нингидрина растворяют в 100 мл смеси ацетона и бутанола (1:1, по объему)]. Пробирку не встряхивают ([35]. Инкубацию продолжают при 37 °С в течение 10 мин. Положительная реакция: появление темно-фиолетовой окраски за счет глицина, образующегося при гидролизе гиппурата. Отрицательная реакция: отсутствие окраски или наличие лишь слабого фиолетового оттенка. Следует использовать контрольные пробы с микроорганизмами, для которых реакция уже известна.

20.1.28. Образование сероводорода

Метод 1. Используют длинную пробирку с агаровой средой, содержащей 0,025% цитрата железа (III)-аммония или 0,015% сульфата железа(II). Среда должна содержать источник органической серы (обычно пептон), а также тиосульфат натрия (от 0,008 до 0,03%), так как некоторые бактерии могут образовывать H2S лишь из одного из этих источников серы. Образование сульфида обычно лучше всего происходит в анаэробных или полуанаэробных условиях, поэтому инокулируют столбики агара. Положительная реакция: почернение среды во время роста за счет образования сульфида железа (разд. 20.1.54).

Примеры: положительный результат — Proteus vulgaris; отрицательный — Escherichia coli.

Метод 2. Этот метод более чувствителен, чем метод 1. Фильтровальную бумагу разрезают на полоски 5X20 мм и погружают в раствор 5%-ного ацетата свинца. Полоски стерилизуют в пробирках, закрытых ватными тампонами, и сушат в сушильном шкафу. Инокулируют пробирку с жидкой средой, содержащей источники серы (см. метод 1). Перед инкубацией в пробирку помещают бумажную полоску так, чтобы ее конец находился приблизительно на 1,3 см выше уровня среды; верхнюю часть полоски можно закрепить ватной или какой-либо другой пробкой. Полоска не должна соприкасаться со средой. Точно так же готовят и неинокули-рованные контрольные пробирки. Положительная реакция: почернение нижней части полоски после нескольких дней инкубации.

20.1.29. Образование индола

Метод 1. Инокулируют безуглеводную и 'безнитрит-ную жидкую среду, содержащую источник триптофана (например, 1%-ный триптоновый бульон или среду с 0,1% L-триптофана). Испытывают культуры различного возраста следующим способом: добавляют 1 мл ксилола (или толуола, насыщенного водой), культуру сильно встряхивают для экстрагирования индола и затем оставляют до образования на поверхности слоя ксилола. Держа пробирку наклонно, вливают 0,5 мл реактива Э)рлиха (разд. 20.4.5) тонкой струйкой по стенке пробирки до образования слоя между ксилолом и бульоном. Пробы оставляют стоять 5 мин. Положительная реакция: образование красного кольца под слоем ксилола. Проверяют так же контрольную пробу с неинокулированной средой. Примечание: если ростовая среда содержит углевод, синтез триптофаназы — фермента, ответственного за образование индола, — может подавляться [21]. Кроме того, обнаружению индола может препятствовать нитрит в концентрации 0,75 мг/мл или выше [87]; поэтому присутствие нитрата в среде может приводить к ложноположительному результату, если организм способен восстанавливать нитрат до нитрита. Примеры: положительный результат — Escherichia coli; отрицательный — Enterobacter aerogenes.

Метод 2. Этот метод менее чувствителен, чем метод 1, однако он не требует применения воспламеняющихся и токсичных растворителей. При его применении экстракцию ксилолом не проводят и используют реактив Ковача (разд. 20.4.7), а не Эрлиха. 0,5 мл реактива добавляют в бульонную культуру и пробирку осторожно встряхивают. Положительная реакция: появление красной окраски.

Метод 3. Фильтровальную бумагу разрезают на полоски и опускают в слегка подогретый насыщенный раствор щавелевой кислоты. При охлаждении на полосках образуются кристаллы кислоты. Полоски тщательно высушивают (стерилизация нагреванием необязательна) и перед инкубацией помещают их с соблюдением правил асептики в пробирку с культурой. Полоски не должны соприкасаться со средой, их следует изогнуть так, чтобы они были прижаты к стенке пробирки и оставались около ее отверстия при закрывании ватной пробкой или завинчивающейся крышкой. Положительная реакция: окрашивание в процессе роста культуры бумажной полоски в розовый или красный цвет.

20.1.30. Образование 2-кетоглюконата при окислении глюкозы

Культуру выращивают в бульоне Хейнса (разд. 20.3.15), содержащем 4% глюконата калия (стерилизованного фильтрованием и внесенного с соблюдением правил асептики). В процессе инкубации через различные периоды времени отбирают пробы по 1 мл и добавляют к ним 1 мл реактива Бенедикта (разд. 20.4.1). Смесь нагревают в бане с кипящей водой в течение 10 мин и быстро охлаждают. Положительная реакция: образование желто-коричневого осадка оксида меди. Примеры: положительный результат — Pseudo-monas aeruginosa; отрицательный — Escherichia coli.

20.1.31. Образование 3-кетолактозы при окислении лактозы [19]

Культуру выращивают на скошенной среде, содержащей 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы, 2% СаС03 и 1,5—2,0% агара. Выросшую культуру снимают петлей с косяка и помещают в виде небольшой капли диаметром около 5 мм на поверхность лактозного агара в чашке Петри (1% лактозы, 0,1% дрожжевого экстракта, 2% агара). На одной чашке можно проверить от 4 до 6 различных штаммов. После 1—2 дней инкубации поверхность агара заливают тонким слоем реактива Бенедикта (разд. 20.4.1). Положительная реакция: образование желтого кольца оксида меди(1) вокруг зоны роста, достигающего максимальной величины через 2 ч (приблизительно 2—3 см).

Примеры: положительный результат — Agrobacte-rium tumefaciens и A. radiobacter; все остальные бактерии, изученные к настоящему времени, дают отрицательную реакцию.

20.1.32. Лецитиназа

Желточный агар (разд. 20.3.14) в чашке засевают штрихом для получения изолированных колоний. Положительный результат: образование мутной (непрозрачной) зоны вокруг колоний. См. также «Липаза» (разд. 20.1.33).

Примеры: положительный результат — Clostridium perfringens; отрицательный — Clostridium butyricum.

20.1.33. Липаза

Метод 1 [7j. Желточный агар (разд. 20.3.14) в чашке Петри засевают штрихом. После инкубации снимают крышку чашки и внимательно просматривают поверхность при косом освещении. Положительный результат: образование маслянистого блестящего с переливами или перламутрового слоя над колонией и вокруг нее на поверхности агара.

Примеры: положительный результат — Clostridium sporogenes; отрицательный — Clostridium butyricum.

Метод 2. Этот метод применяют для эфиров пальмитиновой, стеариновой и олеиновой кислот [83]. Используют агаровую среду с добавлением 0,01% СаС12-Н20. Стерилизуют твин 40 (эфир пальмитиновой кислоты), твин 60 (эфир стеариновой кислоты) или твин 80 (эфир олеиновой кислоты) автоклавированием при 121 °С в течение 20 мин. Добавляют стерильный твин в расплавленную агаровую среду при 45—50 °С до конечной концентрации 1% (по объему). Среду встряхивают до полного растворения твина, разливают по чашкам Петри, оставляют до затвердения и засевают штрихом. Положительный результат: появление мутного ореола вокруг колоний. При исследовании под микроскопом видно, что ореолы состоят из кристаллов кальциевого мыла.

Примеры: положительный результат (твин 80) — Pseudomonas aeruginosa; отрицательный — Pseudomo-nas putida.

Метод 3. Этот метод применяют для жиров различных типов [12]. Готовят жир нужного типа, окрашенный нильским голубым сернокислым (разд. 20.4.11). Добавляют 1 мл эмульсии растопленного жира к 20 мл агара, расплавленного и охлажденного до 45—50 °С. Хорошо перемешивают, разливают по чашкам Петри и после затвердения агара делают посев штрихом. Положительная реакция: образование синего ореола вокруг колоний.

20.1.34. Лизиндекарбоксилаза

См. метод 1 для определения аргининдезиминазы (разд. 20.1.5). Вместо аргинина добавляют 1% дигидро-хлорида L-лнзина (или 2% DL-формы лизина).

Примеры: положительный результат — Serratia таг-cescens; отрицательный — Proteus vulgaris.

20.1.35. Потребление малоната

Пробирку с малонатным бульоном (разд. 20.3.21) инокулируют молодой жидкой культурой или культурой, снятой с агарового косяка. Инкубируют при 37 °С в течение 48 ч. Положительная реакция: изменение зеленой окраски на густо-синюю.

Примеры: положительный результат — Klebsiella pneumoniae; отрицательный — Escherichia coli.

20.1.36. Разложение мяса анаэробами [7]

Инокулируют предварительно восстановленный бульон, содержащий рубленое мясо (разд. 20.3.10), и одновременно пропускают через пробирку очищенную от кислорода двуокись углерода. Инкубация длится 21 день. Положительный результат: разрушение частиц мяса с образованием рыхлой порошкообразной массы на дне пробирки.

Примеры: положительный результат ?— Clostridium sporogenes; отрицательный — Clostridium butyricum.

20.1.37. Тест с метиловым красным

Инокулируют пробирку с бульоном MRVP (разд. 20.3.24). Инкубация при 30 °С продолжается в течение 5 дней (в большинстве случаев достаточно 48-ч инкубации при 37 °С). Добавляют 5—6 капель раствора метилового красного (растворяют 0,1 г метилового красного в 300 мл 95%-ного этанола и разбавляют дистиллированной водой до 500 мл). Положительная реакция: появление ярко-красной окраски, свидетельствующей о том, что рН раствора < 4,2. Отрицательная реакция: желтая или оранжевая окраска. Слабая положительная реакция: красно-оранжевая окраска.

Примеры: положительная реакция — Escherichia coli; отрицательная