— Enterobacter aerogenes.

20.1.38. Воздействие на молоко

Метод 1. Инокулируют пробирку с лакмусовым молоком (разд. 20.3.20). Реакции культур могут быть следующими. Подкисление: появление розовой окраски. Подщелачивание: появление синей окраски. Восстановление лакмуса: молоко становится белым за счет обесцвечивания лакмуса; обычно это происходит в нижней части пробирки. Кислый творожистый осадок: твердый розовый сгусток, который растворяется в щелочи и не сжимается. Творожистый осадок сычужного типа: мягкий нерастворимый в щелочи сгусток, при сжатии которого отделяется сероватая сыворотка. Пептони-зация (протеолиз): молоко становится полупрозрачным в результате гидролиза казеина, начинающегося чаще в верхней части столбика среды; кроме того, среда часто становится щелочной.

Метод 2 [7]. Этот метод применяют для анаэробов. Инокулируют предварительно восстановленную молочную среду (разд. 20.3.22), одновременно пропуская через пробирку двуокись углерода, очищенную от кислорода. Инкубация продолжается 3 нед. Проверяют наличие творожистого осадка и (или) пептонизации.

20.1.39. Подвижность

Готовят влажные препараты из молодых бульонных культур (т. е. находящихся в экспоненциальной фазе роста), выращенных при двух различных температурах (например, 37 и 20°С). В некоторых случаях на средах, содержащих глюкозу, подавляется образование жгутиков [15]. Методы исследования с помощью светового микроскопа описаны в разд. 3.3.4. Влажные препараты изучают сразу после приготовления. При исследовании анаэробов лучше всего рассматривать среднюю часть препарата, а при исследовании аэробов — области около воздушных пузырьков и у края препарата. Не все клетки должны быть подвижными. Для того чтобы штамм бактерий был признан подвижным, необходимо обнаружить хотя бы одну клетку, меняющую свое положение по отношению по меньшей мере к двум другим клеткам [12]. Примечание: подвижность следует отличать от броуновского движения (беспорядочного «покачивания» клеток) и от пассивного движения за счет потоков, образующихся под покровным стеклом.

Движения анаэробов можно также наблюдать в капиллярной трубке, если набрать в нее немного бульона и запаять сразу же оба конца капилляра в узком кислородном пламени [3]. Капилляр рассматривают с достаточно сильным объективом без иммерсии.

Некоторые бактерии, например принадлежащие к порядкам Myxobacteriales и Cytophagales, не имеют жгутиков, но обладают «скользящей подвижностью» при контакте с твердой поверхностью. Методы обнаружения и наблюдения за «скользящей подвижностью» описаны в разд. 3.3.4.

20.1.40. Восстановление нитрата и денитрификация

Приготовление реактивов описано в разд. 20.4.12. Там же можно найти сведения об их канцерогенных свойствах.

Метод 1 [66]. Данный метод используют при количественном определении нитритов. Для этого инокулируют подходящую жидкую среду, содержащую 0,1% KNO3 и 0,17% агара (последний добавляют для получения полужидкой консистенции и создания полуанаэробных условий). Инокулят смешивают со средой очень осторожно, равномерно распределяя его по пробирке. Вовремя инкубации периодически просматривают культуры для обнаружения пузырьков, что является предварительным указанием на денитрификацию. Контрольные культуры, выращенные без нитрата, не должны выделять газ и давать положительную реакцию на нитриг по методу, описанному ниже. Для определения способности микроорганизмов восстанавливать нитрат в нитрит берут по 0,1 мл культур различного возраста и до-бавляют к ним по 2 мл диагностического реактива (разд. 20.4.12). Затем добавляют воду до конечного объема 4 мл и оставляют на 15 мин для развития окраски. Интенсивность окраски измеряют визуально по пятибалльной шкале или с помощью спектрофотометра при 540 нм. Накопление нитрита с увеличением возраста культуры означает восстановление нитрата до нитрита,, в то время как образование вначале нитрита с последующим снижением его уровня означает способность к дальнейшему восстановлению нитрита. Если красная* окраска не появляется, добавляют до 5 мг цинковой пыли на каждый миллилитр смеси. Если нитрат в среде не восстановился, то добавление цинка приведет к era химическому восстановлению, о чем свидетельствует появление красной окраски. Отсутствие окраски означает, что организм восстановил весь нитрит и, по-видимому, произошла денитрификация. В этом случае положительную реакцию на нитрит можно получить при тестировании более молодой культуры. Примечание'. цинковая пыль при длительном хранении может инакти-вироваться, поэтому следует периодически проверять ее способность восстанавливать нитрат в нитрит на неино-кулированной пробе.

Примеры: реакция денитрификации — Pseudomonas aeruginosa; восстановление нитрата в нитрит — Escherichia coli; отрицательный результат — Bacillus sphaeri-cus.

Метод 2. Этот метод используют для качественного определения нитрита. Бактерии выращивают так же, как в методе 1. Периодически проверяют наличие в культуре пузырьков газа, что является предварительным указанием на денитрификацию. К культурам различного возраста добавляют по 1 мл растворов А и Б (разд. 20.4.12). Розовая или красная окраска свидетельствует о присутствии нитрита. При отсутствии окраски наличие нитрата в культуре проверяют с помощью цинковой пыли, как описано в методе 1. Если не обнаруживается ни нитрит, ни нитрат, вероятно, произошла денитрификация. Контрольные опыты, описанные в методе 1, пригодны и для метода 2.

Другим способом доказательства образования газа является выращивание микроорганизма в нитратном бульоне (без агара) с маленьким перевернутым поплавком. При этом можно визуально наблюдать за накоплением газа во время денитрификации.

Метод 3 [66]. Этот метод позволяет обнаруживать оксид азота, образующийся при денитрификации, и обеспечивает более надежное доказательство наличия денитрификации, чем метод 1 или 2. Инокулируют пробирки или колбы с полужидкой нитратной средой. Закрывают сосуды пенициллиновыми пробками и шприцем через пробку вводят газообразный ацетилен, полученный, как описано в разд. 20.2.7, до конечной концентрации 1% (по объему). Ацетилен предотвращает дальнейшее восстановление оксида азота N2O, образовавшегося в процессе денитрификации, до N2 [18]. После того как культура вырастает, отбирают шприцем пробы газа и определяют присутствие N2O методом газовой хроматографии на колонке 274 смX4,8 мм с порапаком Q (80—100 меш) при 35°С, используя детектор по терма-проводности, а в качестве газа-носителя гелий.

20.1.41. Гидролиз нуклеиновых кислот

Метод 1. Этот метод используют для обнаружения как дезоксирибопуклеазы (ДНКазы), так и рибонуклеа-зы (РНКазы). ДНК и РНК (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) растворяют в дистиллированной воде в концентрации, достаточной для получения 0,2%-ного содержания в агаровой среде. ДНК легко растворяется в воде. Для растворения РНК в воду медленно добавляют 1 н. NaOH, следя за тем, чтобы рН не был выше 5,0. Раствор нуклеиновой кислоты добавляют в агаровую среду непосредственно перед автоклавированием (121 °С, 15 мин) и разливают среду в чашки после охлаждения до 50 °С. Делают посев культуры штрихом на твердой среде. После инкубации на поверхность агара наливают 1 н. НС1. Положительная реакция: появление вокруг участка роста чистой зоны, свидетельствующее о наличии ДНКазной или РНКазной активности.

Примеры: положительный результат (ДНКаза) — Serratia marcescens; отрицательный (ДНКаза) — Ente-robacter aerogenes.

Метод 2. Этот метод используют только для теста на ДНКазу. Перед автоклавированием добавляют 100 мг толуидинового синего О (Allied Chemical Corp., New York, N. Y.) на литр диагностической среды, содержащей ДНК (см. метод 1) [79]. В ином варианте добавляют раствор метилового зеленого (разд. 20.4.9) до конечной концентрации 0,005% [85]. На среде с толуидино-вым синим делают посев тест-организма штрихом через-всю чашку, а на среде с метиловым зеленым культуру сеют истощающимся штрихом для получения отдельных, колоний. Положительная реакция: появление ярко-розовой зоны вокруг участка роста на чашках с толуиди-новым синим и бесцветной зоны на зеленом фоне чашки* с метиловым зеленым. Эти методы дают более удобную-для наблюдения реакцию иа ДНКазу, чем метод L Примечание: методы с использованием указанных красителей не следует применять для бактерий, выращиваемых в анаэробных условиях, поскольку индикаторная система может не сработать [75].

Метод 3 [32]. Этот метод применяют в качестве более быстрого теста на ДНКазу, однако он не позволяет обнаруживать очень низкую ДНКазную активность [32]. Готовят диагностическую среду, содержащую 31,5 мг ДНК (Difco Laboratories), 5,0 мл 0,1 М СаС12 и 5,0 мл 0,1 М MgCl2 в 100 мл трис-буфера, рН 7,4. Делают густую (молочного цвета) суспензию культуры в 0,5 мл этой среды и инкубируют 2 ч при 37 °С. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 1,6 мл раствора метилового зеленого (разд. 20.4.9), а затем смешивают 2 капли этого раствора с суспензией бактерий. После перемешивания смесь инкубируют еще 2 ч при 37 °С. Положительная реакция: отсутствие окраски. Отрицательная реакция: сине-зеленая окраска.

20.1.42. 0/129

На поверхность инокулированного агара в чашке Петри помещают 1—2 кристалла 2,4-диамино-6,7-диизо-пропилптеридинфосфата (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). В другом варианте стерильные бумажные диски (диаметром 6—8 мм) импрегнируют раствором этого реактива (0,1 г в 100 мл ацетона), высушивают м помещают в чашки с инокулированной агаровой средой. Положительная реакция: вокруг кристаллов или дисков видна зона подавления роста.

Примеры: положительный результат — Vibrio para-haemolyiicus] отрицательный — Escherichia coli.

20.1.43. Оптохин

Стерильный имеющийся в продаже (Difco Laboratories, BBL Microbiology Systems) оптохиновый диск для дифференциации микроорганизмов или стерильный бумажный диск, импрегнированный 0,02 мл 0,025%-ного раствора оптохина (гидрохлорида этилгидрокупреина; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), помещают на поверхность инокулированной агаровой среды в чашке Петри. Положительная реакц