ия: вокруг диска видна зона подавления роста.

Примеры: положительный результат — Streptococcus pneumoniae; отрицательный — другие альфа-гемолитические стрептококки.

20.1.44. Орнитиндекарбоксилаза

См. метод 1 с использованием аргининдезиминазы (разд. 20.1.5). Вместо аргинина используют 1%-ный раствор дигидрохлорида L-орнитина (или 2%-ный раствор DL-формы).

Примеры: положительный результат — Enterobacter aerogenes; отрицательный — Proteus vulgaris.

20.1.45. Оксидаза

Метод 1, На отрезок фильтровальной бумаги наносят несколько капель 1%-ного раствора дигидрохлорида тетраметил-п-фенилендиамина (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), приготовленного в тот же день. Выросшую культуру снимают с поверхности агаровой среды платиновой петлей (обычные петли из нихромовой проволоки могут давать ложноположительную реакцию) и наносят ее на увлажненную бумагу. Положительная реакция: развитие фиолетовой или пурпурной окраски в течение 10 с.

Примеры: положительный результат — Pseudomo-nas aeruginosa; отрицательный — Escherichia coli.

Метод 2. Этот метод менее чувствителен, чем метод 1, но он более удобен. Несколько капель смеси (1 : 1, по объему) 1%-ного а-нафтола, растворенного в 95%-ном этаноле, и свежеприготовленного 1%-ного водного раствора оксалата диметил-п-фенилендиамина (Difco Laboratories) наносят на колонии в чашках с агаром. В другом варианте к жидкой культуре добавляют 0,2 мл а>-нафтола и 0,3 мл диметил-м-фениленди-амина и энергично перемешивают. Положительная реакция: окрашивание колоний или бульонной культуры в фиолетово-синий цвет в течение 10—30 с.

20.1.46. O/F-тест

Готовят основной раствор исследуемого углевода (обычно глюкозы), стерилизуют его путем фильтрования и добавляют с соблюдением правил асептики при 45—

50 °С в автоклавированную полужидкую основную среду до конечной концентрации 0,5—1%. Чаще всего используют основную среду Хью и Лейфсона [44] (разд. 20.3.17). Если микроорганизмы не способны расти на этой среде из-за недостатка необходимых питательных веществ, добавляют дрожжевой экстракт (0,1%) или сыворотку крови (2%). Когда кислотообра-зование маскируется веществами щелочной природы, образующимися из пептона, можно использовать среду Борда и Холдинга [20] (разд. 20.3.8). Если рост тестируемого микроорганизма ингибируется содержащимся в среде бромтимоловым синим, следует заменить его такими индикаторами, как феноловый красный или бромкрезоловый пурпурный. Для морских бактерий целесообразно использовать модифицированную для теста O/F (MOF) среду Лейфсона [55] (разд. 20.3.19).

Для осуществления теста пробирки с полужидкой средой, содержащей углеводы, помещают на несколько минут в кипящую водяную баню ^ля удаления большей части растворенного кислорода; затем их быстро охлаждают и столбики среды инокулируют с помощью прямой иглы. После инокуляции среду в одной из пробирок покрывают 10-мм слоем стерильного растопленного петролатума (это так называемая «анаэробная» пробирка). Среду во второй пробирке ничем не покрывают («аэробная» пробирка). Для выявления неспецифических реакций готовят контрольные пробы: 1) инокулируют такую же среду, не содержащую углевода 2) инкубируют стерильную среду с углеводом.

Результаты интерпретируют следующим образом. 1) Если кислота образуется только в аэробной пробирке, клетки катаболизируют углевод с использованием Ог (реакция «О»). В этой пробирке рост должен быть заметным. 2) Если подкисление происходит и в аэробной, и в анаэробной пробирках, клетки способны также к брожению (реакция «F»). Рост должен быть заметен в обеих пробирках. 3) Если кислота не образуется ни в одной из пробирок, клетки не способны катаболизиро-вать углевод. Если рост отсутствует, возможно, что в среде нет какого-либо питательного вещества, необходимого для роста изучаемого микроорганизма.

Примеры: реакция «F» с глюкозой — Staphylococcus epidermidis; реакция «О» с глюкозой — Micrococcus varians; отрицательный результат с глюкозой — Pseu-domonas lemoignei.

20.1.47. Фенилаланиндезаминаза

Густо засевают скошенный агар с фенилаланином (разд. 20.3.26). После инкубации наносят сверху на косяк 4—5 капель 10%-ного раствора хлорида железа (III). Положительная реакция: появление зеленой окраски, свидетельствующей об образовании фенилпи-рувата.

Примеры: положительный результат — Proteus vulgaris; отрицательный —? Escherichia coli.

20.1.48. Фосфатаза

Метод 1. Этот метод используют для определения присутствия как кислой, так и щелочной фосфатазы. В агаровую ростовую среду, например питательный агар (разд. 20.3.25), расплавленный и охлажденный до 45— 50 °С, добавляют с соблюдением правил асептики достаточное количество 1%-ного раствора натриевой соли дифосфата фенолфталеина (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), стерилизованного фильтрованием, до конечной концентрации 0,01%. Чашки с инокулированным штрихом агаром инкубируют от 2 до 5 дней. На крышку перевернутой чашки наносят 1 каплю раствора нашатырного спирта (удельный вес 0,880, концентрация 28—30%) и вставляют в них перевернутые чашки с культурой, для того чтобы пары аммиака достигли колоний. Положительная реакция: в результате образования свободного фенолфталеина колонии становятся красными.

Примеры: положительный результат — Staphylococcus aureus; отрицательный — Micrococcus varians.

Метод 2 [22]. Этот метод применяют для обнаружения только кислой фосфатазы. Готовят очень густую суспензию клеток в физиологическом растворе (0,85% NaCl). 0,3 мл суспензии добавляют к 0,3 мл раствора субстрата, содержащего 0,1 М цитратный буфер, рН 4,8, и 0,01 М динатрий-п-нитрофенилфосфат (Sigma Chemical Co.). Смесь инкубируют 6 ч при 37°С. Затем добавляют 0,3 мл 0,04 М глицинового буфера, рН которого доводят до 10,5 с помощью МаОН. Ставят также контрольные пробы без бактерий. Положительная реакция: появление желтой окраски, свидетельствующей об активности кислой фосфатазы.

Метод 3. Этот метод применяют для обнаружения только щелочной фосфатазы. Он совпадает с методом 2 с той лишь разницей, что п-нитрофенилфосфат растворяют не в цитратном, а в глициновом буфере. Для развития желтой окраски добавления глицинового буфера не требуется.

20.1.49. Присутствие поли-р-гидроксибутирата [53, 90J

Выращивают бульонную культуру микроорганизмов в условиях, способствующих образованию поли-р-гидра-ксибутирата (ПГБ). Для аэробных бактерий такими условиями являются лимитирование экспоненциального роста по азоту при избытке источников углерода и энергии, а также лимитирование по кис!лороду.

Предварительные доказательства присутствия ПГБ (разд. 3.3.11) можно получить в реакциях окрашивания1, однако для точного определения требуется химический анализ.

Химический анализ. 1 мл культуры вносят в коническую стеклянную центрифужную пробирку, добавляют к нему 9 мл щелочного гипохлорита (разд. 20.4.19) и инкубируют 24 ч при комнатной температуре [90]. В другом варианте к 2 мл культуры добавляют 8 мл 5%-ного гипохлорита (имеющейся в продаже хлорной извести) и инкубируют [72]. Гипохлорит расщепляет большинство клеточных компонентов, но не расщепляет гранулы ПГБ. Смесь центрифугируют для сбора гранул, а прозрачную надосадочную жидкость удаляют. Осадок промывают, суспендируя его в 10 мл дистиллированной воды, центрифугируют и надосадочную жидкость удаляют. Еще раз промывают водой, затем дважды 10 мл ацетона и, наконец, дважды 10 мл диэтилового эфира. Осадок высушивают и добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты. Пробирку помещают в кипящук> водяную баню на 10 мин. Охлаждают ее содержимое до комнатной температуры и с помощью УФ-спектрофотомстра в кварцевых кюветах снимают спектр оптической плотности пробы по точкам от 215 до 255 нм через каждые 5 нм. В контрольную кювету вносят концентрированную серную кислоту. (Если оптическая плотность при 235 нм превышает 1,0, то пробу следует развести серной кислотой в соотношении 1 : 10 или выше.) Положительная реакция: наличие пика оптической плотности при 235 нм благодаря присутствию кротоновой кислоты, образующейся из ПГБ под действием серной кис лоты.

Примеры: положительный результат — Pseudomonas lemoignei; отрицательный — Pseudomonas aeruginosa.

20.1.50. Гидролиз поли-р-гидроксибутирата [88]

Способность к гидролизу ПГБ является важным свойством с точки зрения дифференциации бактерий рода Pseudomonas; однако необходимой для анализа суспензии гранул ПГБ нет в продаже и приготовить ее довольно сложно. Подробности приготовления этой суспензии описаны в разд. 20.4.15.

Готовят агар без источника углерода, как описано в разд. 20.2.5, и разливают его в чашки. Ко второй порции среды, расплавленной и охлажденной до 45—50 °С, добавляют достаточное количество стерильной концентрированной суспензии гранул ПГБ до конечной концентрации в среде 0,25% (вес/объем). Агаризованную суспензию гранул наливают в чашки с затвердевшей средой для образования тонкого поверхностного слоя.

После того как поверхностный слой затвердеет, отмытую суспензию испытуемого микроорганизма засевают на небольшом участке агара в чашке. (В одной чашке можно испытывать несколько штаммов.) Инкубация продолжается несколько дней. Положительная реакция: рост бактерий на инокулированном участке и появление зон просветления за счет деполимеризации гранул ПГБ.

Примеры: положительный результат — Pseudomonas lemoignei; отрицательный — Pseudomonas acidovo-rans.

20.1.51. Пиоцианин и другие феназиновые пигменты

Инокулируют косяк со средой А (разд. 20.3.1) и затем просматривают его через 24, 48 и 72 ч. Положительная реакция: появление пигментов, диффундирующих в агар и окрашивающих его. В некоторых случаях пигменты могут лишь слабо растворяться в воде и осаждаться в виде кристаллов в среде.

Примеры: пиоцианин — голубая окраска среды — Pseudomonas aeruginosa; феназин-1 -карбоксильная кислота — желто-оранжевая окраска, возможна кристаллизация в колониях и окружающих колонии участках среды — Pseudomonas aerofaciens; оксихлорорафин — бледно-желтая окраска среды — Pseudomonas chlororap-his. Хлорорафин очень слабо растворим, он скапливается в виде отдельных