Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 3

Автор Ф.Герхардт

зеленых кристаллов в участках роста на утолщенном конце косяка — P. chlororaphis,

20.1.52. Споры (эндоспоры)

Окрашивание спор описано в разд. 3.3.7. Среды для роста культур должны содержать достаточные количества ионов Са2+ и Мп2+. Инокулируют среды с углеводами и без них и изучают культуры различных возрастов, Примечание; не Следует ошибочно принимать за эндоспоры гранулы включений (например, ПГБ).

Когда обнаруживают спороподобные структуры, необходимо подтвердить наличие спор в опыте с нагреванием. Пробирку с бульоном инокулируют выросшей на твердой или жидкой среде культурой, в которой предполагают спорообразование. При этом стараются избегать контакта инокулята со стенками пробирки. Пробирку помещают в водяную баню при 80 °С вместе с контрольной пробиркой, снабженной термометром, в которой содержится неинокулированный бульон. Необходимо убедиться в том, что уровень воды в бане выше уровня бульона. Инкубируют 10 мин начиная с того момента, когда температура достигнет 80°С. Пробирку охлаждают, инкубируют при оптимальной температуре и определяют наличие роста. Примечание: некоторые эндоспоры, например у определенных штаммов Clostridium boiulinum, при 80 °С могут погибнуть; в этом случае при определении устойчивости спор к нагреванию используют более низкие температуры (например, 75 или 70°С). Для подтверждения спорообразования применяют также «поппинг-тест» (разд. 3.3.7). Некоторые виды Nocardia образуют «хламидоспоры», или «микроцисты», которые могут выдерживать температуру 80 °С в течение нескольких часов и все же не являются истинными эндоспорами.

20.1.53. Гидролиз крахмала

Готовят агаровую среду, на которой культура способна хорошо расти, добавляют 0,2% растворимого крахмала и кипятят. Среда не должна содержать глюкозы, так как в ее присутствии гидролиз крахмала может ингибироваться [93]. Среду стерилизуют при 115°С в течение 10 мин и делают посев одним штрихом через центр чашки с крахмальным агаром. После инкубации агар заливают раствором иода (можно использовать иод, применяемый для окраски по Граму). Положительный тест: появление бесцветного участка вокруг зоны роста.

Примеры: положительный результат — Bacillus suo-tilis; отрицательный — Escherichia colu

20.1.54. Диагностические тесты с использованием агаровой среды, содержащей три сахара и железо

Скошенный агар, содержащий три сахара и железо (разд. 20.3.34), инокулируют прямой иглой. Вначале засевают уколом до дна пробирки утолщенный конец косяка, а затем иглу извлекают и наносят штрихи на поверхность агара. Пробирку закрывают ватной пробкой или чем-то подобным, чтобы обеспечить доступ воздуха к среде. Чашки просматривают после инкубации при 37 °С в течение 18—24 ч. При этом можно получить три типа данных:

1. Брожение Сахаров

Кислая реакция среды в утолщенной части агара (желтая окраска) и щелочная в скошенной (красная окраска) свидетельствуют о сбраживании глюкозы, но не сахарозы или лактозы.

Кислая реакция в утолщенной части агара и кислая реакция в скошенной (равномерно желтый косяк) свидетельствуют о сбраживании лактозы и (или) сахарозы.

Щелочная реакция среды в утолщенной части агара и щелочная реакция в скошенной (равномерно красный косяк) свидетельствуют об отсутствии сбраживания.

2. Образование газа

Об образовании газа свидетельствуют пузырьки в утолщенной части косяка. Большое количество газа может разорвать агар или выбросить его вверх.

3. Образование сероводорода

Об образовании сероводорода свидетельствует почернение утолщенной части косяка в результате реакции H2S с сульфатом железа (II)-аммония, продуктом которой является сульфид железа.

20.1.55. Уреаза

Метод 1. Инокулируют скошенный агар Кристенсена с мочевиной (разд. 20.3.12) и инкубируют. Положительный результат: появление красно-фиолетовой окраски.

Примеры: положительный результат — Proteus vulgaris; отрицательный — Escherichia coli.

Метод 2 [47]. Этот метод используется для микроорганизмов, не растущих на агаре Кристенсена с мочевиной. Готовят раствор, содержащий: 0,1065% БЭС-буфера [N,N-6HC- (2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоно-вая кислота; ICN Pharmaceuticals, Cleveland, Ohio], 2,0% мочевины и 0,001 % фенолового красного, рН 7,0. Стерилизуют фильтрованием и разливают с соблюдением правил асептики по 2,0 мл в небольшие пробирки. Бульонную культуру центрифугируют и к клеткам добавляют стерильную дистиллированную воду или физиологический раствор для получения густой суспензии. В пробирку со средой, содержащей мочевину, добавляют 0,5 мл клеточной суспензии. Инокулируют также контрольную среду без мочевины. Пробирки инкубируют 24 ч. Положительный тест: (появление красно-фиолетовой окраски.

20.1.56. Реакция Фогес— Проскауера

Инокулируют две пробирки с бульоном MRVP (разд. 20.3.24). Одну пробирку инкубируют при 37° С, а другую — при 25° С. Через 48 ч 1 мл культуры перекосят в другую пробирку, добавляют 0,6 мл 5%-ного (вес/объем) а-нафтола, растворенного в абсолютном этаноле, и тщательно перемешивают. Затем добавляют 0,2 мл 40%-ного водного раствора КОН. Вновь хорошо перемешивают и инкубируют, установив пробирку наклонно для увеличения площади поверхности среды (реакция зависит от доступа кислорода). Пробирку просматривают через 15 и 60 мин. Положительный тест: окрашивание поверхности среды в интенсивный красный цвет.

Примеры: положительный результат — Enterobacter aerogenes; отрицательный — Escherichia coli.

20.1.57. Потребности в факторах X и V

Чашки с агаром, содержащим соево-казеиновый гид-ролизат (разд. 20.3.31), инокулируют следующим образом. Стерильный ватный тампон смачивают в суспензии, отжимают на стенке пробирки для удаления лишней жидкости и проводят им по всей поверхности чашки (не повреждая агара). Используют стерильные бумажные полоски, пропитанные Х-фактором (гемом) или V-фак-тором (NAD, DPN), которые можно приобрести у Difco Laboratories, Detroit, Mich, или BBL Microbiology Systems, Cockeysville, Md. Полоску с Х-фактором помещают предварительно прокаленным в пламени пинцетом на поверхность инокулированного агара. На расстоянии 2 см от нее помещают полоску с V-фактором. Чашки инкубируют 1—2 дня. Результаты интерпретируют следующим образом. Наличие роста только вокруг одной полоски (с Х- или V-фактором) означает потребность в соответствующем факторе. Наличие роста только на участке между двумя полосками означает потребность в обоих факторах. Наличие роста на всей поверхности чашки означает, что микроорганизм не нуждается ни в одном из факторов.

Примеры: положительная реакция и на Х-, и на V-фактор — Haemophilus haemolyticus; положительная реакция только на V-фактор — Haemophilus parainflu-enzae; отрицательная реакция и на Х-, и на V-фактор— Escherichia coll.

20.2. СПЕЦИАЛЬНЫЕ ТЕСТЫ

20.2.1. Определение метаболитов методом газовой хроматографии ([7]; см. также разд. 16.3.4)

Кислоты и спирты

Методики, описанные ниже, были разработаны для идентификации анаэробов, но их можно также использовать для аэробов и факультативно анаэробных микроорганизмов. 1 мл культуральной среды, содержащей глюкозу или другие сбраживаемые углеводы, помещают в пробирку размером 12X75 мм и подкисляют 0,2 мл 50%-ной (по объему) H2S04; подкисленные образцы можно хранить для последующего анализа. Добавляют 0,4 г NaCl и 1 мл диэтилового эфира. Пробирку закрывают корковой пробкой и ее содержимое перемешивают, осторожно переворачивая пробирку около 20 раз для перехода свободных жирных кислот в эфирную фазу. Смесь центрифугируют несколько минут и отделяют верхний слой эфира от слоя воды. Не следует удалять слишком много эфира, чтобы вместе с ним не попала вода. Эфирный слой помещают в другую пробирку размером 12X75 мм и добавляют безводный СаСЬ (4— 20 меш) в количестве, равном примерно ]Д объема эфира, для удаления растворенной воды. Отбирают 14 мкл и вводят в газовый хроматограф для анализа коротко-цепочечных летучих жирных кислот и спиртов. Неино-кулированную среду подкисляют, экстрагируют и используют в качестве контроля.

Пировиноградная, молочная, фумаров!Я и янтарная кислоты нелетучи, и поэтому для анализа методом газовой хроматографии их следует перевести в метиловые эфиры. 1 мл культуры помещают в пробирку размером 12X75 мм и добавляют 2 мл метанола и 0,4 мл 50%-ной H2S04. Вместо метанола можно добавить 2 мл мета-нольного раствора трехфтористого бора (BF3), который продается любой торговой организацией, поставляющей реактивы для хроматографии. Смесь нагревают 30 мин при 60 °С. В пробирку добавляют 1 мл воды и 0,5 мл хлороформа, плотно закрывают и осторожно переворачивают пробирку приблизительно 20 раз. Удаляют слой хлороформа (нижний слой) и вводят 14 мкл в газовый хроматограф.

Рекомендуется использовать газовый хроматограф с детектором по теплопроводности (ТП). Можно использовать пламенно-ионизационный детектор (ПИД), однако при этом нельзя обнаружить муравьиную кислоту. Применяют колонку из нержавеющей стали, алюминия или стекла длиной 1,8 м и внутренним диаметром 6 мм. Колонку заполняют сорбентом Supelco SP-1000, 100—200 меш (Supelco Inc., Bellefonte, Pa.) или 5%-ным FFAP на хромосорбе G. И летучие жирные кислоты, и их метиловые эфиры анализируют на одной и той же колонке. Температура термостата колонок 135—145 °С. В качестве газа-носителя используют гелий, скорость потока которого равна 120 см3/мин. Если прибор снабжен отдельными нагревателями для дозатора и детектора, их температуру устанавливают на 20—30 °С выше температуры колонки. Используют самописец на 1 мВ со скоростью движения бумаги 1,3 см/мин. Готовят стандарты для летучих кислот, спиртов и нелетучих кислот (разд. 20.4.18) и экстрагируют их так же, как пробы с культурой. Такие стандарты можно приобрести у любой торговой организации, поставляющей реактивы для хроматографии.

О наличии или отсутствии, а также о приблизительных количествах различных конечных продуктов метаболизма судят по профилю, который можно использовать для идентификации бактерий. Дополнительные количественные данные можно получить методом абсолютной калибровки, используя стандартные калибровочные крив

страница 8
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 3" (2.64Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.10.2019)