TRANSCRIPTION AND TRANSLATION A PRACTICAL APPROACH

Edited by B. D. HAMES Department of Biochemistry, University of Leeds, Leeds, England S. J. HIGGINS Department of Biochemistry University of Leeds, Leeds, England

IRL PRESS Oxford-Washington DC

Транскрипция трансляция

? J О Л

Под редакцией Б. ХЕЙМСА, С. ХИГГИНСЛ

Перевод с английского канд. биол. наук

А. М. колчинского

и

канд. биол. наук Н. В. СОНИНОЙ

под редакцией

чл.-корр. АН СССР Е. Д. СВЕРДЛОВА

Москва «Мир» 19В7

ББК 28.04 Т65

УДК 575 + 577.1

Гердон Дж., Спандидос Д., Уилки Н., Колмен ?., Мэн-ли Дж., Марзлаф У., Хуан Р., Гилмор С, Стоукер Н., Пратт Дж., Холланд Б., Клеменс М., Минтер С, Сили П.

Транскрипция и трансляция. Методы: Пер. с англ ./Под Т65 ред. Б. Хеймса и С. Хиггинса. — М.: Мир, 1987. 400 с, ил.

Книга английских авторов вышла в хорошо зарекомендовавшей себя серим «Практические подходы» издательства IRL Press. В ней изложены новые методы изучения экспрессии генов (главным образом эукариот) на уровне транскрипции и трансляции, причем подробное теоретическое обоснование сочетается с тщательным описанием техники работы. По содержанию книга не перекрывается с ранее изданными руководствами по методам генной инженерии.

Для специалистов в области молекулярной биологии и биотехнологии.

2001040000—456

? 041(01)—87 137~87 ч- 1 ББК 28.04

Редакция литературы по биологии

§1984 IRL Press Limited перевод на русский язык» t -----, «Мир», 1987

; НАУЧНАЯ ЬК5ДИ0ТЕКА> j »а. Н. И. Лсбачввскоги

ПРЕДИСЛОВИЕ РЕДАКТОРА ПЕРЕВОДА

Если сегодня мы имеем представление о том, что такое промоторы и терминаторы, энхансеры и сайленсеры, как осуществляется процессинг РНК, какие структурные элементы РНК важны для инициации трансляции и какие белковые факторы участвуют в этом процессе, то это является следствием разработки простых и эффективных методов исследования экспрессии генов на разных уровнях. Благодаря им получена информация об участии генов в процессах развития и дифференцировки, в опухолевой трансформации, в процессах вирусных инфекций и иммунном ответе организма как на эти инфекции, так и на вторжение любых чуждых для организма антигенов. И этот перечень достижений можно было бы при желании продолжить. Как это обычно бывает при любом исследовании, всегда возникает ситуация, когда с помощью уже известных методов удается решить наиболее очевидную часть проблемы и на первый план выдвигаются новые ее аспекты, которые раньше, на прежнем уровне наших знаний, оставались в тени. Эти новые аспекты, перерастающие в новые проблемы, или вновь возникающие проблемы требуют совершенствования старых и разработки новых методов. С этой точки зрения важно представлять возможности имеющейся сегодня методической базы в решении задач сегодняшнего дня и в приспособлении ее к перспективным исследованиям.

Если говорить о сегодняшнем дне, то совершенно очевидно, что существует сформировавшаяся группа методов, рутинно используемых во всем мире для решения самых разнообразных задач, которые объединены тем, что каждая из них так или иначе связана с экспрессией генов и ее регуляцией. Сейчас уже можно, по-видимому, с достаточной уверенностью утверждать, что эта группа методов будет еще очень долго служить основой развития молекулярной биологии и молекулярной генетики (это не исключает, конечно, и появления новых подходов). Поэтому очень важно, чтобы исследователь, приступающий к изучению какой-либо проблемы в этой области, применял хорошо разработанные стандартные приемы. Стандартизация методов в науке не менее важна, чем в промышленности. Она

6

Предисловие редактора перевода

позволяет сопоставлять и сводить воедино результаты, получаемые в разных лабораториях. По-видимому, не будет большим преувеличением сказать, что решение любой задачи обязательно следует начинать с применения имеющихся стандартных подходов, и только если они не работают, нужно их изменять, но изменять на основе полученного опытным путем представления, почему не работают стандартные методы.

Появившиеся недавно методические пособия [такие, например, как ставшая уже настольной лабораторной книгой «Молекулярное клонирование» Т. Маниатиса и др. (Москва, Мир, 1984)] представляют собой попытки ввести стандартизацию в методы научного поиска. Такого рода пособием является и предлагаемая советскому читателю книга «Транскрипция и трансляция. Методы». В ней описаны устоявшиеся методы, рутинно применяющиеся для исследования различных этапов транскрипции и трансляции. Среди них — методы введения чужеродной генетической информации в клетки млекопитающих и селекции образующихся трансформантов, методы исследования транскрипции и процессинга РНК в ооцитах Xenopus laevis, в клеточных экстрактах, в изолированных клеточных ядрах, методы сопряженной транскрипции — трансляции в прокариотических системах и методы трансляции эукариотической мРНК в бесклеточных экстрактах и в ооцитах Xenopus.

Авторы книги являются известными специалистами в данной области, и публикуемые методики отражают их личный опыт, что придает изложению особую ценность. Важно, что каждая из глав носит критический и творческий характер, т. е. в ней рассматриваются не только достоинства разработанного автором метода, но и его недостатки, область применения и перспективы развития. Чисто методические разделы логично сочетаются с теоретическим обоснованием методов, а их применение проиллюстрировано на примере решения конкретных задач. С этой точки зрения книга является не только методическим пособием, но и обзором достижений в области исследования экспрессии генов.

Несомненно, это издание будет полезно и опытным исследователям, и ученым, начинающим работать в этой области, и студентам, которые могут при первом чтении опустить методические прописи, даваемые в таблицах, и ознакомиться с проблемами исследований экспрессии генов и основами применяющихся здесь методов.

Е. Д. Свердлов

ПРЕДИСЛОВИЕ

Исследование транскрипции генов и судьбы соответствующих мРНК было и остается основой изучения как механизма экспрессии генов, так и ее регуляции. Кроме того, в последнее время методы молекулярной биологии и молекулярной генетики начинают применяться все большим числом исследователей-биологов. Цель настоящей книги состоит в том, чтобы дать подробное описание лабораторных методик, применяющихся в этой важной области исследований. Мы рассматриваем вирусные, прокариотические и эукариотические гены, причем среди последних описываем в основном те, которые транскрибируются РНК-полимеразой II. Чтобы избежать ненужных повторений и в то же время включить все важнейшие методики, пришлось значительно переработать некоторые из представленных авторами глав, и мы благодарим их за то, что они с готовностью пошли на это. Однако в тех случаях, когда существуют несколько заслуживающих внимания вариантов одного и того же метода, мы приводим их полностью.

Б. Хеймс С. Хиггинс

ВВЕДЕНИЕ

Дж. Гердон

Все, кто занимается молекулярной и клеточной биологией, хорошо понимают, насколько важны экспериментальные системы для анализа генной экспрессии, но, возможно, имеет смысл выделить два основных направления работ в этой области: определение механизма экспрессии генов и анализ ее регуляции. В первом случае идентифицируют молекулы, необходимые для экспрессии какого-либо гена. Для этого определяют, какая из нескольких клонированных ДНК кодирует продукт данного гена и какая из множества фракций РНК содержит нужную мРНК. Ответы на такие вопросы легко получить, используя соответствующие бесклеточные системы. Располагая бесклеточ-ными системами, содержащими очищенные компоненты, можно также идентифицировать факторы, необходимые для правильной транскрипции ДНК и трансляции мРНК. Во втором случае решают гораздо более трудную задачу: пытаются установить механизм регуляции генной экспрессии. Для этого нужно знать, с какой скоростью осуществляется каждый этап генной экспрессии, и идентифицировать те компоненты, которые являются лимитирующими для каждой из стадий. Глубокий анализ генной регуляции потому и труден, что любой компонент реакции может стать лимитирующим при определенных экспериментальных условиях, хотя многие из этих условий, возможно, никогда не встречаются в норме in vivo. Выяснить, является ли данный компонент, лимитирующий реакцию in vitro, лимитирующим ее также in vivo, весьма непросто. При анализе механизма генной экспрессии этой проблемы не возникает, поскольку даже при иных, чем в норме, концентрациях компонентов в бесклеточной системе ее кодирующая способность и потребность в главных факторах не должны изменяться.

В идеале следует стремиться получить такую бесклеточную систему, которая целиком состояла бы из известных компонентов, а генная экспрессия в ней была бы адекватна экспрессии генов in vivo. Таких систем очень мало. Почти все наиболее употребительные бесклеточные системы содержат неочищенные экстракты, к которым добавляются очищенные компоненты, такие, как клонированная ДНК или мРНК. Подавляющее большинство систем, описанных в этой книге, относится именно к

Введение

9

этому классу. Система другого типа представляет собой целые клетки, в которые инъецируются определенные очищенные компоненты. Эта система оказалась более перспективной, чем предполагалось вначале. Когда клетки разрушаются, получающийся лизат обычно содержит в большом количестве ДНКазы, РНКазы и протеолитические ферменты, и на первых же этапах приготовления бесклеточных систем от всех этих компонентов необходимо избавиться или уменьшить их активность. Когда же в целую клетку инъецируют раствор ДНК или мРНК, составляющий примерно 10% объема клетки, молекулы деградируют весьма незначительно. Именно поэтому микроинъекция ДНК или мРНК в живые клетки является важным и полезным методом анализа экспрессии генов. В этом сборнике описаны различные методы и системы для микроинъекции.

Наконец, важно понимать сравнительную ценность бесклеточных систем и систем с микроинъекцией для исследования генной экспрессии. Бесклеточные системы, в особенности такие, компоненты которых в о