м использовать тот или иной клон.

4. Векторы на основе вирусов

Как говорилось в предыдущих разделах этой главы, наиболее распространенный метод введения последовательностей клонированной ДНК в реципиентные клетки млекопитающих — это

44

Глава 1

Экспрессия экзогенной .ДНК в клетках млекопитающих

45

трансфекция с помощью изолированных рекомбинантных плаз-мид или фаговых ДНК; данный метод предполагает использование ДНК в качестве вектора. Альтернативный метод состоит в использовании вирусов эукариот; при этом клонированная ДНК вводится в клетку в результате обычной вирусной инфекции. Недавно было опубликовано несколько обзоров о применении таких векторов на основе вирусов [68, 69]. Имеются два типа вирусных векторов: литические вирусы типа вируса полиомы и SV40 и так называемые «челночные векторы» на основе ретровирусов и папилломавирусов. В последнем случае эукариотические клетки содержат кольцевые эписомные копии ре-комбинантного вектора, и эти копии могут быть экстрагированы и использованы непосредственно для трансформации бактерий.

4.1. Векторные системы

на основе литических вирусов

Наличие многочисленных данных по структуре и функциям SV40 [55] позволяет широко использовать этот вирус в качестве источника генетического материала, т. е. источника промоторов и энхансеров как для векторов на основе ДНК, так и для вирусных векторов. При условии что имеются соответствующие хелперные вирусы, рекомбинантные геномы SV40 можно упаковать в инфекционные вирусные частицы. После инфицирования клеток-хозяев рекомбинантными SV40 образующиеся гибридные мРНК подвергаются обычному процессингу и транслируются [70, 71]. Важное усовершенствование векторов SV40 было связано с получением линий клеток COS [72]. Эти клетки несут интегрированные геномы SV40, дефектные по сигналам начала репликации (ori), и векторные вирусы SV40, дефектные по ранним генам, могут размножаться в них без помощи хелперного вируса [73]. Однако активно реплицирующийся SV40 является цитотоксичным и, кроме того, включает фрагменты чужеродной ДНК только ограниченных размеров (до 2,5 kb). Позднее были исследованы другие векторные системы, основанные на литических вирусах: аденовирусах [74, 75], вирусах герпеса [76] и вирусах осповакцины [77], которые способны включать фрагменты чужеродной ДНК гораздо большего размера.

4.2. Векторные системы на основе ретровирусов

Большинство эукариотических векторных систем, в которых для амплификации рекомбинантного генома используются вирусные частицы, основаны на применении литических вирусов

(разд. 4.1), обладающих очень серьезным недостатком — они убивают клетки. В идеале хотелось бы получить стабильную клеточную линию, способную постоянно реплицировать и экс-прессировать донорную ДНК. Многими ценными с точки зрения использования в качестве векторов свойствами обладают ретро-вирусы. Они реплицируются с образованием промежуточной формы — кольцевой провирусной ДНК, которая эффективно интегрируется ? хромосому клетки-хозяина по механизму, свойственному трднспозонам, и не обязательно являются цитоток-сичными. Разработкой векторов на основе ретровирусов активно занимаются несколько лабораторий, и уже сообщалось об успешном размножении рекомбинантных ретровирусов, содержащих tk-геп HSV (разд. 3.1.1) или gpt-ven ?. coli (разд. 3.1.5) {78—81]. В такие векторы могли бы быть введены сигналы начала репликации и селектируемые маркеры для прокариотиче-ских клеток, что позволило бы перенести их прямо в бактериальные клетки. Сейчас имеются мутантные по упаковке ретро-вирусы, которые можно использовать для получения рекомбинантных вирусов, не нуждающихся в хелперах [81, 82]. Интересную перспективу открывает использование ретровирусных векторов для введения генов в клетки зародышевого пути животных 183].

43. Векторы на основе папилломавирусов

Другой подход к получению стабильной клеточной линии, предназначенной для постоянной репликации и экспрессии донорной ДНК, не связан с использованием ретровирусов. Он основан на разработке систем, в которых донорная ДНК реплицируется как эписома. Эписомные системы имеют еще одно

Рис. 9. Векторы на основе вируса папилломы. Конструирование pBVI-DI описано в работе [Щ, pBPV-HI —в работе [91] pBPV-tk — в работе [92]. Пунктирные линии обозначают плазмидные последовательности, сплошные — последовательности BPV; заштрихованные полоски — последовательности tk-rena. HSV. Карты даны без соблюдения масштаба. ? — EcoRl, В — ВатШ, ? — fiindlU, Pv — РииП, ori — место начала репликации pAT153, pBR — последовательности плазмиды pBR322, Amp — ген ?-лактамазы, рАТ — последовательности плазмиды рАТ153.

46

Глава 1

Таблица 18. Использование челночных векторов на основе BPV

После трансформации клеток млекопитающих челночным вектором на основе BPV последовательности, содержащие ДНК BPV, обнаруживаются в ядре в виде множественных эписомных копий. Эту ДНК можно выделить из супернатанта методом Хирта [93] и затем прямо использовать для трансформации бактериальных клеток. ?рансфор.ищия клеток млекопитающих

1. Проведите трансфекцию мышиных клеток ???3?3 или С127 рекомбинант-ными плазмидами, содержащими трансформирующие гены ДНК BPV-1 (см. рис. 9), с помощью кальций-фосфатного метода (табл. 1).

2. Выделите трансформированные колонии и снимите их, пользуясь цилиндрами для клонирования (табл. 1). Перенесите трипсинизированные клетки во флаконы (площадь роста 25 см2), содержащие по 5 мл среды Хэма SF12, в которой присутствует сыворотка «Hyclone» в концентрации 5%.

3. Выращивайте клетки на этой среде, пока их количество не станет достаточным для выделения ДНК. Для получения большого количества клеточной массы лучше использовать флаконы большего размера (площадь роста 75 см2).

Выделение ДНК из супернатанта по методу Хирта [93]

1. Слейте ростовую среду и промойте клетки дважды раствором 0,15М NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 7,4, стараясь не повредить клеточный монослой.

2. Осторожно добавьте 20 мл 0,6%-ного ДСН, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, на один флакон (с площадью роста 75 см2), содержащий 1—2· 107 клеток, так чтобы среда распределилась равномерно. Проинкубируйте 20 мин при комнатной температуре, в покое.

3. Аккуратно слейте раствор в стеклянную пробирку Согех (Du Pont). При необходимости пользуйтесь, резиновой палочкой.

4. Заклейте пробирку парафильмом и перемешайте содержимое, 10 раз осторожно перевернув пробирку. Проинкубируйте пробирку в течение ночи, а еще лучше 72 ч, при 4 °С.

5. Отцентрифугируйте содержимое пробирки при 15 000g 30 мин. Отберите супернатант и еще раз отцентрифугируйте остаток для получения дополнительного количества супернатанта, если в этом есть необходимость.

6. Проведите экстракцию обеих порций супернатанта фенолом, насыщенным 10 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0.

7. Отделите водный слой центрифугированием и вновь проведите экстракцию равным объемом смеси хлороформ — изоамиловый спирт (24 : 1 по объему).

8. Отделите водный слой центрифугированием. Осадите ДНК добавлением 2,5 объемов этанола и оставьте на ночь при —20 °С.

9. Соберите ДНК центрифугированием при 12 000 g 10 мин.

10. Растворите осадок ДНК в 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0 (1 мл на исходное количество клеток с площади роста 75 см2) и отднализуйте против этого буфера.

Выход ДНК в этом методе составляет примерно 10 мкг, и лишь небольшая часть ее представляет собой ДНК BPV. Трансформация бактерий плазмидной ДНК [94, 95] 1. Приготовьте следующие растворы и среды:

L-бульон (табл. 4) Буфер для трансформации

0,10 ? СаС12

0,25 ? КС1

5 мМ MgCb

10 мМ RbCl

5 мМ трис-HCl, рН 7,6

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

47

Простерилизуйте раствор фильтрованием Буфер для хранения 0,10 ? СаС12 0,25 ? КС1 5 мМ MgCl2 10 мМ RbCl 5 мМ трис-HCl, рН 7,6 15%-ный глицерол

Простерилизуйте этот раствор фильтрованием Чашки с агаром

Приготовьте бактериологический агар: 5,0 г NaCl

5,0 г триптона (Difco)

2,5 г дрожжевого экстракта (Difco)

6,0 г бакто-агара (Difco)

Дистиллированная вода до 500 мл Проавтоклавируйте агар и дайте ему остыть до 50 °С. Затем добавьте необходимые антибиотики. Выбор антибиотика зависит от селектируемого бактериального гена, присутствующего в плазмидной ДНК; для гена ?-лактамазы следует добавлять ампициллин до конечной концентрации 100 мкг/мл. Хорошо перемешайте агар и разлейте его по 20 мл на чашку Петри (10 см диаметром).

2. Посейте 1 мл ночной бактериальной культуры в 200 мл L-бульона во флаконе на 1 л. Выращивайте клетки со встряхиванием, пока Ац5о не достигнет 0,6.

3. Соберите бактерии центрифугированием при 5 000g 10 мин при 4 °С.

4. Осторожно ресуспендируйте клетки в 100 мл буфера для трансформации. Оставьте во льду на 20 мнн.

5. Соберите клетки центрифугированием, как в п. 3.

6. Осторожно ресуспендируйте клетки в 20 мл буфера для хранения. Отберите по 1 мл бактериальной суспензии в стерильные пробирки и храните при — 70 °С.

7. Разведите плазмидную ДНК (в количестве до 40 нг), которой будет проводиться трансформация, в буфере для трансформации до конечного объема 0,2 мл. Добавьте 0,2 мл свежеприготовленных или размороженных бактерий (см. п. 6) и оставьте на льду на 25 мин.

8. Перенесите в водяную баню, нагретую до 37 °С. Проинкубируйте 5 мин при этой температуре.

9. Добавьте 1 мл L-бульона в каждую пробирку и проинкубируйте при 37 °С в течение 1 ч без встряхивания. За это время у бактерий должна восстановиться жизнеспособность и начать экспрессироваться устойчивость к антибиотикам.

10. Рассейте по 0,2 мл клеток на приготовленные чашки с бактериологическим агаром. Подержите чашки при комнатной температуре 10—15 мин, чтобы впиталась влага.

И. Переверните чашки и проинкубируйте их при 37 °С. Колонии должны появиться через 12—15 ч. По этой прописи можно получить 5-Ю5—5-10" трансформантов Е. coli НВ1011 на 1 мкг интактной ДНК pBR322.

1 Компетентные клетки НВ101 можно хранить при — 70 °С без заметного снижения эффективности трансформации. При использовании других бактериальных штаммов может потребоваться исп