ользовать на стадии 7 свежеприготовленные клетки.

преимущество: при их использовании снимаются проблемы, связанные с упаковкой. Папилломавирусы отличаются от других паповавирусов тем, что трансформированные ими клетки содержат не интегрированную вирусную ДНК [84—86], а 50—

48

Глава!

300 копий кольцевой вирусной ДНК в свободном виде. В качестве примера рассмотрим вирус папилломы быка (BPV). Ре-комбинантные плазмиды, содержащие трансформирующую область ДНК BPV, могут эффективно индуцировать морфологическую трансформацию мышиных клеток С127 или фибробла-стов ???3?3. Для трансформации необходимо только 69% генома BPV-1. Трансформированные клетки несут рекомбинант-ные геномы в виде эписом, и в них осуществляется правильная экспрессия эукариотических генов, встроенных в рекомбинант-ную плазмиду, например гена ?-интерферона человека [90] или гена ?-глобина человека [91]. Более того, показано [91, 92], что BPV-рекомбинантные плазмиды можно выделить из фракции низкомолекулярных ДНК супернатанта, полученного по методике Хирта [93], для последующей трансформации Е. coli. Таким образом, BPV-векторы в сочетании с подходящими клетками-хозяевами образуют прекрасную систему челночных векторов для клеток млекопитающих. Структура некоторых челночных векторов на основе BPV показана на рис. 9, а их использование описано в табл. 18. Следует отметить, что эта система применима главным образом к клеткам млекопитающих, склонным к морфологической трансформации, индуцируемой BPV, например к клеткам NIH3T3 или С127.

5. Экспрессия перенесенных генов

Механизмы включения донорной ДНК в реципиентные клетки и последующей экспрессии этой ДНК недостаточно ясны. Вскоре после введения ДНК начинается фаза временной генной экспрессии. Вероятно, во время этой фазы нововведенные гены превращаются в мини-хромосомы [96]. При селективных условиях трансформированные колонии появляются через 1—3 нед с частотой, отражающей, по-видимому, начальный уровень генной экспрессии во временной фазе.

5.1. Временная экспрессия

Когда для переноса генов используется кальций-фосфатная методика (разд. 2.1), длительность фазы временной экспрессии составляет 2—3 сут. Кинетические кривые экспрессии, полученные путем измерения тимидинкиназной активности (табл. 12) и с помощью спот-гибридизационного теста на ТК-мРНК (работа [43] и табл. 14) в случае клеток ВНКТК- и LATK-, приведены на рис. 10. Видно, что максимум экспрессии гена tk в клетках ВНК и LA достигается соответственно через 24 ч и 48 ч после трансфекции.

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

49·

О 12 24 48 72 96

Время, ч

Рис. 10. Временная экспрессия ??-гена HSV в клетках мыши и хомячкаи А. Активность HSV-тимидинкиназы в лизатах клеток LATK- или ВНКТК-, которые были трансфицированы рекомбинантной плазмидой, несущей tk-тт HSV. Использовалась плазмида pTKMOLTRl (см. рис. 12), а трансфекцию-клеток проводили методом, описанным в табл. 1. Копреципитат ДНК—фосфат кальция удаляли из клеток через 6 ч после начала инкубации и заменяли среду на свежую неселективную. Через определенные интервалы времени клетки центрифугировали, ресуспендировали до концентрации 2-Ю7 клетка/мл в 50 мМ трис-HCl (рН 7,5), 5 мМ ?-меркаптоэтаноле и 5 мкМ дезок-ситимидине и обрабатывали ультразвуком. Лизаты хранили при —70 °С до. момента определения активности HSV-TK методом, описанным в табл. 12. Б Содержание HSV-tt-мРНК в клетках LATK- и ВНКТК-, трансфицирован-ных рекомбинантной плазмидой pTKMOLTRl. Из клеток, полученных так, как это описано выше, отбирали пробы для выделения РНК (см. табл. 13). С помощью спор-гибридизации проводили анализ этой РНК на присутствие HSV-^-мРНК (см. [43] и табл. 14). По 20 мкг каждой РНК наносили на нитроцеллюлозные фильтры (делали по две параллели) и проводили гибридизацию с Bglll-Sstl ^-специфичным фрагментом ДНК длиной 0,6 kb, меченным 32Р методом ник-трансляции. С фильтров были получены радиоавтографы и проведен их количественный денситометрический анализ. Среднее по двум параллельным дотам для каждой точки выражено в условных единицах.

4—953

50

Глава 1

О 10 20 10 20

Относительный уровень временной ? Относительный уровень временной экспрессии экспрессии

Рис. 11. Корреляция между временной экспрессией и эффективностью трансформации рекомбинантными плазмидами, содержащими последовательности — регуляторы транскрипции из различных эукариотических генов. А. Зависимость временного уровня tk-uPHK от эффективности трансформации. Б. Зависимость временного уровня ТК от эффективности трансформации. Плазмиды ?????(?), рТК1(#), pTKeSVl(A), pTKeSV2(A), ????????(?) и ???????2(?) несут /fe-ген HSV, находящийся под контролем различных последовательностей — регуляторов транскрипции, в том числе энхансера SV40 (pTKeSVl и pTKeSV2) и энхансера MoMuSV (???????? ирТКеМОЕ2). Полученные результаты отнесены к соответствующим величинам для стандартной плазмиды ?????, не несущей энхансерных последовательностей (рис. 12). Все эти данные получены по результатам работы [98].

Имеющиеся данные позволяют думать, что считывание tk-re-на правильно инициируется и терминируется, а транскрипты подвергаются процессингу [90, 91, 97]. Так, из рис. 11 видно, что существует четкая корреляция между относительным содержанием образующейся ?/е-мРНК и количеством синтезируемой тимидинкиназы. Аналогичные результаты были получены для гена cat в опытах по временной экспрессии (см. работы [46—48] и разд. 3.1.4).

5.2. Стабильная трансформация

При селективных условиях колонии трансформированных клеток появляются через 1—3 нед после трансфекции кальций-фосфатным методом. В случае трансфекции /й-геном HSV ТК+-трансформированные колонии можно подсчитывать и от-

Экспрсссия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

51

бирать через 7 сут, если в качестве реципиентов используются клетки ВНК, и через 10—14 сут, если используются LATKr-клетки. Частота трансформации для нормального ^-гена HSV составляет 2000—4000 колоний на 1 мкг. Однако ген tk (см. разд. 5.3) можно поставить под контроль разных эукариотических сигналов регуляции транскрипции. Активность полученных таким образом разных гибридных генов существенно различается как в опытах по временной экспрессии, так и в опытах по стабильной трансформации [10, 98]; частота трансформации варьирует в пределах четырех порядков величины. Чувствительность теста на трансформацию на два порядка выше, чем у теста на временную экспрессию (разд. 5.1). На рис. 11 проводится прямое сравнение уровня временной экспрессии tk-гена и эффективности трансформации для ряда гибридных /й-генов [10, 98]. Видно, что имеет место четкая корреляция между уровнем временной экспрессии tk-тена и частотой последующей трансформации. Таким образом, начальный уровень экспрессии, возможно, играет главную роль в определении эффективности трансформации. Тем не менее, несмотря на эту корреляцию, в линиях стабильно трансформированных клеток на первых пассажах можно обнаружить лишь очень небольшие различия в количествах //г-ДНК, (&-мРНК и тимидинкиназы [98]. Это наводит на мысль о существовании дополнительной генетической регуляции, проявляющейся при росте клеток на селективной среде HAT. Аналогичные исследования с другими селектируемыми генами пока не проводились.

Когда клетки растут в культуре, число копий и состояние донорной ДНК сложным образом меняется [2, 4]. Состояние донорной ДНК в стабильно трансформированных клетках в какой-то степени зависит от последовательности ДНК, регулирующей экспрессию tk-тена. Данные по трансфекции tk-генои, полученные в работе [99], позволяют предположить, что на какой-то стадии трансфекции происходит активная рекомбинация между проникшими в клетку молекулами ДНК, приводящая к образованию комплексов внехромосомной ДНК, в которых селектируемый ген связан с ДНК-носителем. При использовании гибридных tk-тенов с низкой частотой трансформации стабильно трансформированные клетки обычно содержат 5—10 копий тандемно дуплицированной ДНК, по-видимому, без существенной перестройки последовательности [4, 98]. В большинстве случаев трудно определить, включается ли такая тандем-ная структура в хромосомы, но имеются некоторые данные о существовании внехромосомных копий tk-гена [2, 4, 100]. Напротив, когда используются такие регулирующие транскрипцию последовательности ДНК, которые дают высокую частоту трансформации, стабильно трансформированные культуры содержат

4»

52

Глава 1

только 1—5 копий tk-vma, независимо включившихся в ДНК-носитель или в ДНК реципиентных клеток. В отдельных случаях наблюдалась ограниченная дупликация некоторых интегрированных .копий, в том числе фланкирующих последовательностей ДНК-носителя или ДНК клетки-хозяина [101].

5.3. Изучение последовательностей, регулирующих транскрипцию

В принципе любой ген, для которого разработаны удобные жоличественные тесты, можно использовать для идентификации ,и анализа сигналов р_егуляции транскрипции в геномной ДНК. Вообще говоря, основной подход заключается в получении делеции и замещений в нормальной регуляторной последовательности или в добавлении к ней экзогенных регуляторных сигналов и последующем анализе изменений генной экспрессии с помощью метода генного переноса. Простой пример такого рода -с использованием трансформации (й-геном представлен на .рис. 12. Нормальный промотор //е-гена расположен между PvuU- и Б^Ш-сайтами плазмиды pTKl. Делеция промотора и его замещение одним Яш^Ш-сайтом, в результате которого получается плазмида рТКЮ, приводят к уменьшению уровня генной экспрессии в 500 раз, а встраивание регуляторных последовательностей тена '?-глобина человека, дающее плазмиду ?????, или длинного концевого повтора (LTR) ДНК провируса мышиной саркомы Молони, приводящее к образованию плазмиды pTKMOLTRl, сопровождается реактивацией генной экспрессии. Таким образом, плазмиду рТКЮ можно использовать в качестве вектора замещения для регуляторных последовательностей ДНК. Наприм.ер, ее можно применять для анализа сигналов регуляции транскрипции в геноме папилломавируса [102]. Более высокий уровень генной экспрес