Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

сии, наблюдающийся при использовании LTR-последовательности вируса мышиной саркомы .Молони (МоМиБУ) вместо нормального tk-¦или ?-глобинового промотора, обусловлен влиянием дополнительной регуляторной последовательности, которую называют -энхансером или модулятором. Энхансеры — это короткие последовательности, которые стимулируют активность промоторов. Они действуют независимо от их ориентации в геномной ДНК и от расстояния между ними и промоторами [10, 98, 103, 104]. -Большинство изученных к настоящему времени энхансеров ведут свое происхождение от эукариотических вирусов, но, вероятно, достаточно широко распространены и клеточные энхан-.серные последовательности. На рис. 13 изображены плазмиды, -в которых энхансерные участки, взятые из нескольких эукарио--тических вирусов, находятся на расстоянии примерно 1 kb от

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

53

Рис. 12. Рекомбинантные плазмиды, несущие гибридные гены, которые содержат структурные последовательности /6-гена HSV-1, соединенные с гетеро-логичными эукариотическнми промоторами. Трансформационная эффективность каждой плазмиды проверялась на LATK--клетка? мыши методом, описанным в табл. 1. Эта эффективность, отнесенная к соответствующей величине для нормального гена в pTKl, указана в скобках для каждой рекомбинантной плазмиды. А. Рекомбинантная плазмида pTKL содержащая ВатШ.-фрагмент ДНК HSV-1 длиной 3,5 kb, который несет интактный ген tk. Б. Плазмида рТКЮ; промоторная область г^-гена делетирована. Этот РуцП/бя/П-фрагмент длиной 249 bp был удален, а сайты Pvull и Bglll заменены на сайт НШаШ. В. Плазмида pTHKel. .BamHI/РигШ-фрагмент длиной 197 bp, содержащий промоторные последовательности гена ?-глобина человека, был встроен как ЯшсШЬфрагмент в Hindlll-cam рТКЮ. Г. Плазмида pTKMOLTRl. ?coRI///indI II-фрагмент, содержащий участок длиной 473 bp из MoMuSVLTR и 5'-фланкирующую последовательность ДНК норки, ставит транскрипцию tk-reua под контроль промотора, который в норме регулирует экспрессию вирусного гена MoMuSV. Пунктирные линии — последовательности плазмиды рАТ153, сплошные — последовательности HSV. Наружные жирные полоски изображают последовательности структурного гена tk, внутренние — кодирующие последовательности tk; заштрихованные полоски — это последовательности человека и MoMuSV, несущие промоторные элементы; волнистая линия — последовательности ДНК. норки. Стрелки указывают направление транскрипции. Карты нарисованы без соблюдения масштаба. ? — EcoRI, В —BamHl, H — Hindlll, Pv — Pvull, Bg — BglU, Sm — Smdl, е'р'-промотор ?-глобина человека, MoMuSV—вирус мышиной саркомы Молони. Более подробное описание этих плазмид можно найти в работе [98].

нормального структурного tk-rena и расположены перед ним, если говорить о направлении транскрипции. Способность этих последовательностей усиливать транскрипцию tfe-гена в фазе временной генной экспрессии (разд. 5.1) можно продемонстрировать с помощью норсерн-блот-гибридизации суммарной

54

Глава 1

Рис, 13. Рекомбинантные плазмиды, несущие вирусные энхансерные последовательности. Плазмиды pTK.BVl-201, pTKlSVl и pTKlMOEl несут энхансе-ры вируса бычьей папилломы (BPV-1), обезьяньего вируса 40(SV40) и вируса мышиной саркомы Молони (MoMuSV) соответственно. Они были описаны в работе [10]. Рекомбинантная плазмида рТКВХЭ несет SmaI/?coRT-фрагмент длиной 220 bp, содержащий энхансерную последовательность, локализованную на 100 bp левее сайта инициации транскрипции предранней мРНК HSV-1. Сайт Smal был заменен сайтом ?coRI с помощью молекулярных линкеров. Пунктирные линии — последовательности плазмиды рАТ153, сплошные — вирусные последовательности. Наружные жирные полоски — последовательности структурного гена tk, внутренние'—кодирующие последовательности; заштрихованные полоски — вирусные последовательности, несущие энхансерные элементы; волнистая линия — последовательности ДНК норки; TATA — ТАТА-бокс (последовательности, гомологичные промотору). Стрелки указывают направление транскрипции. Энхансерные участки обозначены через ?'. Таким образом, BV'E', SVE', МО'Е' и HSVE' —это энхансеры BPV-1, SV40, MoMuSV и HSV-1 соответственно. Карты нарисованы без соблюдения масштаба. ? — ?coRI, ? — Hindlll, ? — Pvull, Sm — Smal, Be —Bell, H/Hp — Hindlll/HpaU, В — ВатШ, B(xb) —ВатШ/Xbal.

клеточной РНК из трансфицированных клеток (рис. 14). Процедура выделения суммарной клеточной РНК из трансфицированных клеток для такого рода исследований описана в табл. 13. Метод норсерн-блоттинга рассматривается в гл. 2, разд. 5.2.2. Суть его состоит в том, что выделенные РНК фракционируют путем электрофореза в агарозном геле и затем переносят на мембранный нитроцеллюлозный фильтр. Изучаемые транскрипты выявляют методом гибридизации с соответствующим меченым ДНК-зондом с последующей радиоавтографией. Нормальный ^-транскрипт имеет размеры 1,3 kb, и при наличии энхан-серов (плазмиды pTKBVl-201, pTKlSVl, pTKlMOEl, рТКВХЭ; см. рис. 13) РНК этого размера образуется в больших количествах (в 5—20 раз больше, см. рис. 14), чем в их отсутствие

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

55

? 2

X о

¦

-1,3 kb

Рис. 14. Анализ й-мРНК в трансфицированных клетках с помощью нор-серн-блот-гибридизации. Из мышиных клеток LATK-. трансфицированных ДНК указанных рекомбинантных плазмид, выделили суммарную кле-

точную РНК; пробы по 20 мкг фракционировали в 1%-ном агарозном геле с формальдегидом, переносили на нитроцеллюлозный фильтр и проводили гибридизацию с Bglll/Sst\ ^-специфичным фрагментом кДНК длиной 0,6 kb, меченным 32Р [10]. А. Радиоавтограф. Б. Результат ден-ситометрического сканирования полосы 1,3 kb (tt-мРНК). Структура плазмиды рТК1, содержащей ген tk, но не имеющей энхансерной последовательности, приведена на рис. 1, а структуры плазмид pTKBVl-201, pTKlSVl, pTKlMOEl и рТКВХЭ, содержащих энхансеры BPV-1, SV40, MOMuSV и HSV-1 соответственно,— на рис. 13.

(плазмида рТК1; см. рис. 1). Во многих лабораториях использовали аналогичные методики для различных генных систем с целью анализа промоторов и энхансеров, но для исследования сигналов терминации транскрипции эти подходы пока не применялись.

5.4. Индуцибельные гены

Большой интерес представляет механизм активации генов. Известны гены, экспрессию которых можно индуцировать с помощью гормонов и ионов металлов или путем стимуляции клеток к дифференцировке, а также гены, активность которых регулируется белками, кодируемыми вирусной ДНК. Для изучения участков, ответственных за регуляцию транскрипции таких генов, применяются методы генного переноса. Ниже описан ряд гаких систем, иллюстрирующих применение опытов по генному переносу на практике.

56

Глава 1

5.4.1. Металлотионеиновые гены

Металлотионеины — это вездесущие белки позвоночных. Они -связывают тяжелые металлы и, как считается, участвуют в поддержании гомеостаза цинка и в обеспечении устойчивости к токсическому воздействию тяжелых металлов. Активность ме-таллотионеинового гена 1 (mt-l) мыши регулируется на уровне транскрипции тяжелыми металлами и глюкокортикоидными гормонами, являющимися индукторами в этой системе. Поскольку ген mt-l выполняет функцию «домоуправляющего», для его регуляции, по-видимому, не требуются тканеспецифиче-ские факторы, и, следовательно, эту регуляцию можно изучать в системах разного типа. Когда для трансформации HGPRT--клеток Не La использовали рекомбинантные векторы, содержащие mi-1-ген мыши и gpi-ген ?. coli, то регуляция транскрипции mt-l кадмием сохранялась, а регуляция глюкокортикоидами отсутствовала [105]. Чтобы выяснить, не связано ли это отсутствие реакции на глюкокортикоиды с неспособностью глюко-кортикоидных рецепторов человека взаимодействовать с последовательностями ДНК мыши, клетки мыши LATK- были трансформированы [105] вектором, содержащим интактный ген mt-l и tk-reu HSV-1, или гибридным геном, в котором регуляторная' часть промотора mt-l была соединена с вирусным структурным геном тимидинкиназы (плазмида рМК1). И вновь оказалось, что транскрипция гена mt-l регулируется кадмием, но не глюкокортикоидами. Более того, если клетки мыши были трансфи-цированы гибридным геном, наблюдалась регуляция кадмием тимидинкиназной активности. В опытах по делеционному картированию было показано, что последовательности ДНК, необходимые для регуляции кадмием мышиного гена mt-l, находятся на расстоянии не более 148 bp от места инициации транскрипции [105].

«Промоторные» области гена mt-l были исследованы также с применением метода генного переноса путем микроинъекции. Когда в яйцеклетки мыши была инъецирована плазмида рМК и проведена инкубация с кадмием, тимидинкиназная активность увеличилась приблизительно в 10 раз по сравнению с контролем. Анализ набора делеционных мутантов показал, что последовательность, абсолютно необходимая для осуществления кадмиевой регуляции, находится на расстоянии не более 90 bp от места начала транскрипции [106]. Такая же гибридная плазмида рМК была введена путем микроинъекции в оплодотворенные яйцеклетки мыши с последующей пересадкой яиц другим самкам [107]. Десять из 69 мышей-потомков несли последовательности рМК, а у семи из них в печени наблюдалась высокая активность вирусной тимидинкиназы. Синтез этого фермента

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

57

индуцируется тяжелыми металлами, о чем свидетельствуют результаты исследования тимидинкиназной активности после частичной гепатэктомии при воздействии кадмием или без него. Однако глюкокортикоиды не оказывали на всех исследованных трансгенных мышей никакого влияния. Применимость этого метода введения генов в организм животных была изучена далее с использованием гибридного гена, полученного путем соединения металлотионеинового гена с геном гормона роста. Фрагмент ДНК, содержащий промотор mt-l гена мыши, был соединен со структурным геном гормона роста крысы и микро-инъецирован в пронуклеусы оплодотворенных яйцеклеток мыши [108]. Семь из 21 мыши, развившихся из этих яйцеклеток, несли гибридный ген, а шесть из этих семи животных были значительно крупнее своих собратьев.

5.4.2. Ге

страница 12
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.09.2019)