Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

ны, активность которых изменяется под действием глюкокортикоидов

Считается, что в основе функционирования разных стероидных гормонов лежит один и тот же молекулярный механизм: гормон вначале связывается с тканеспецифичным цитоплазма-тическим рецепторным белком. Это взаимодействие приводит к такому изменению рецептора, при котором увеличивается его сродство к участкам связывания в ядре. В конце концов под действием стероидных гормонов изменяется картина синтезируемых клеткой белков, вероятно, путем изменения транскрипции нескольких специфических генов. Введение в клетки генов, активность которых изменяется под действием гормонов, позволяет создать экспериментальную систему для решения вопроса о том, является ли индуцибельность свойством, присущим определенным нуклеотидным последовательностям. Для этой цели был использован, например, вирус опухоли молочной железы мышей (MMTV) — ретровирус, отвечающий на стимуляцию глюкокортикоидами. Было показано, что клонированная ДНК интегрированного или неинтегрированного провируса, введенная в LATK--^eTKH мыши путем контрансформации с й-геном HSV, транскрибируется с образованием нормальных вирусных РНК. Количество этих транскриптов увеличивается лосле обработки клеток дексаметазоном (синтетическим глюко-кортикоидным гормоном) [109, ПО]. При соединении с геном, кодирующим трансформирующий белок вируса мышиной саркомы Харви, или с геном дигидрофолатредуктазы мыши LTR-последовательность MMTV сообщает гибридному гену способность отвечать на индукцию дексаметазоном [111, 112]. Это дает основания полагать, что последовательности, ответственные за гормональную чувствительность MMTV, принадлежат вирусному LTR,

58

Глава 1

Аналогичные опыты проводились с целью анализа регуляторных последовательностей, необходимых для гормональной регуляции ссги-глобулинового гена в клетках печени крысы [113] и гена гормона роста человека [114].

5.4.3. Глобиновые гены

Семейство глобиновых генов представляет собой великолепную модельную систему для изучения экспрессии тканеспеци-фичных генов и изменения этой экспрессии в процессе развития. И у человека, и у мыши ген главного ?-глобина в норме экс-прессируется только в дифференцированных эритроидных клетках; но когда в фибробласты мыши вводили кальций-фосфатным методом глобиновые гены, содержащие фрагмент ДНК длиной до 1 kb в направлении к 5'-концу от сайта кэпирования мРНК, они экспрессировались в этих клетках [115, 116]. Таким образом, при введении экзогенных глобиновых генов утрачивается некий элемент нормальной регуляции. Тем не менее в некоторых системах наблюдается индукция введенных глобиновых генов во время эритроидной дифференцировки [2]. Рассмотрим один такой пример. Эритролейкемические клетки Френд представляют собой перевиваемые клеточные линии, ведущие свое происхождение от мышиных опухолей, индуцированных вирусом Френд. Они являются предшественниками эритроидов,

А Б

В ?

Рис. 15. А. Рекомбинантная плазмида ??????-?, содержащая ген ?-глобина человека и <й-ген HSV-1. Этот рекомбинант был описан в работе [2]. Экзоны обозначены жирными полосками, а интроны и нетранслируемые участки — заштрихованными, ? — ген ?-глобина человека. Стрелка указывает направление транскрипции. Б. Рестрикционная карта гена ?-глобина человека (ее полярность противоположна полярности карты на рис. А). ДНК-зонд длиной 800 нуклеотидов использовалась для анализа методом норсерн-блот-гибриди-зации ?-глобиновых РНК-транскриптов (рис. 16), а ДНК-зонд длиной 334 нуклеотида—для Sl-нуклеазного картирования этих транскриптов (см. подпись к рис. 17). Указан также сегмент этой ДНК-зонда длиной 65 нуклеотидов, защищенный от нуклеазы ?-глобиновым РНК-транскриптом человека (рис. 17). Карты нарисованы без соблюдения масштаба. ? — EcoRl, ? — Hindll, Ъ — ВатШ, X — Xbal, Hp — Hpal, Ps — Pstl.

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих

59

Рис. 16. Анализ методом норсерн-блот-гибридизации poly(A)+-PHK, выделенной из индуцированных и неиндуцированных клеток эритролейкемии Френд. Клетки F4-12B2TK- были трансформированы рекомбинантной плазмидой ??????-?, в результате чего получены клеточные линии F101, F105 и F107. Аналогичным образом трансформация плазмидой ????????-3 привела к получению клеточной линии F533. Ро1у(А)+-РНК была выделена из 200 мкг суммарной РНК реципиентных (F4-12B2TK-) и трансформированных клеток (F101, F105, F107 и F533). Каждую линию инкубировали в течение 3 сут с ГМБА (3 мМ). Индуцированные препараты отмечены буквой I, неиндуци-рованные — ????. РНК фракционировали в 1%-ном агарозном геле с формальдегидом и затем перенесли на нитроцеллюлозный фильтр. EcoY([jPst\-фрагмент ДНК (800 нуклеотидов), содержащий З'-область гена ?-глобина человека и фланкирующий эту область участок (см. рис. 15, Б), был помечен in vitro 32Р методом ник-трансляции и использован в качестве гибридизациоп-ного зонда. Маркером для глобиновой 9S-PHK служила ?,?,?-глобиновая РНК (5 нг), выделенная из крови плода человека, взятой при заменном переливании. Представлен полученный радиоавтограф. Положения маркерных 28S- и 18S-pPHK были определены при окрашивании геля бромистым этидием.

и после обработки такими химическими индукторами, как ДМСО или гексаметилен-бис-ацетамид (ГМБА), дифференцируются в более зрелые клетки, в которых синтезируется большое количество глобина (главным образом глобина взрослого типа). Когда в ТК_-клетки Френд вводили ген ?-глобина человека, соединенный с ^й-геном HSV (рис. 15 и работа [2]), считывание гена ?-глобина человека правильно инициировалось и терминировалось (D. A. Spandidos, J. Grindley, J. Paul, неопубли-

60'

Глава 1

FTK8--2:

10

1 .0 5 10 Ю 'Si

517-

154-145-

1

Рис. 17. Картирование Б'-конца ?-глобиновой мРНК человека в мышиных эритролейкемических клетках с помощью нуклеазы S1. Одноцепо-чечный /Уш/1-фрагмент (334 нуклео-тида), соответствующий 5'-концу гена ?-глобина человека (рис. 15, Б), был помечен 32Р по 5'-концу и проведена его гибридизация с суммарной РНК из нетрансформированных реципиентных клеток F4-12B2TK-^FTK-) или из этих же клеток, трансформированных pTKHpG-l (клетки FTKB-2). Sl-нуклеазное картирование было проведено методом, описанным ранее (см. работу [117], а также гл. 2, разд. 5.2.2, и гл. 5, разд. 5.2). Использовались две разные концентрации нуклеазы S1 (1000 и 10 000 ед.); им соответствуют цифры 1 и 10 над дорожками на радиоавтографе. Nonl — неиндуцированные клетки, I — индуцированные. В качестве позитивного и негативного контроля использовались ?-глобино-вая мРНК из крови плода человека, взятой при заменном переливании крови, и дрожжевая РНК соответственно. Размеры фрагментов ДНК, защищенных РНК от расщепления нуклеазой S1 (в парах нуклеотидов), указаны с правой стороны радиоавтографа, а размеры ДНК-маркеров (Яш/1-фрагменты плазмиды pBR322) — с левой.

кованные данные). Индукция под действием НМВА приводила к 20—50-кратному увеличению количества глобин-специфичной РНК (рис. 16). Далее был определен сайт инициации транскрипции генов глобиновых мРНК с помощью метода Sl-нукле-азного картирования. Этот метод подробно описан в гл. 5, разд. 5.2. Он основан на гибридизации РНК-транскриптов с подходящей меченой ДНК-зондом, в данном случае с фрагментом ДНК длиной 344 нуклеотида, комплементарным 5'-концу |3-гло-бинового гена человека и 5'-фланкирующим последовательностям (см. рис. 15,5). Получившиеся гибриды инкубируют с нуклеазой-Sl, которая расщепляет только одноцепочечную ДНК, но не ДНК в составе гибридных комплексов, и определяют размеры оставшихся фрагментов ДНК методом электрофореза

Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих.

в геле. Если РНК-транскрипт имеет правильный 5'-конец, он должен защитить от расщепления сегмент ДНК-зонда длиной в 65 нуклеотидов (рис. 15, ?); остальная часть молекулы ДНК останется в одноцепочечной форме и поэтому будет расщеплена. Как показано на рис. 17, длина сегмента ДНК,, защищенного глобин-специфичными РНК-транскриптами, составляла 65 нуклеотидов, и, следовательно, эти транскрипты имели правильный 5'-конец и их синтез был правильно инициирован. Аналогичные результаты были получены в опытах с геном ?-глоби.-на человека [2, 118, 119].

5.4.4. Другие индуцибельные гены

Сейчас известны и многие другие индуцибельные генные системы, для исследования которых применяются методы, аналогичные описанным выше. К ним относятся гены интерфероном (они индуцируются при вирусной инфекции или под действием, poly (I), poly (С); [45, 120, 121]), гены белков теплового шока [122—124], иммуноглобулиновые гены [125] и гены антигенов тканевой совместимости [126, 127], а также вирусные гены, такие, как предранний ген HSV [128] и tk-ren HSV [129, 1301-

Благодарности

Авторы благодарны Организации по изучению рака в Великобритании за поддержку, Джесуэ Лангу за плодотворное обсуждение и разрешение ссылаться на неопубликованные данные, Джоан Гриндлей за предоставление данных по Sl-нукле-азному картированию и Эфраиму Кэму за предоставление рис. 6, Б к В.

Литература

1 Graham F. L, van der Eb A. J. Virology, 52, 456 (1973).

2. Spandidos D. ?., Paul J. ? MB О J., 1, 15 (1982).

3. McKnight S. L. Cell, 31, 355 (1982).

4. Spandidos D. ?., Harrison P. R., Paul J. Exp. Cell Res., 141, 149 (1982)-.

5 Birnboim H. C., Doly J. Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979).

6 Ishiura M., Hirose S., Uchida Т., Hamada Y., Suzuki Y., Okada Y. Mol. CelP Biol., 2, 607 (1982).

7 Gross-Bellard M., Oudet P., Chambon P. Eur. J. Biochem., 36, 32 (1973).

8 Yoder J. I., Ganesan A. T. Mol. Cell Biol., 3, 956 (1983).

9 Wigler M., Pellicer ?., Silverstein S., Axel R. Cell, 14, 725 (1978). 10 Spandidos D. ?., Wilkie ?. ?. EMBO J„ 2, 1193 (1983).

11. Stow N. D., Wilkie N. M. J. Gen. Virol., 33, 447 (1976). 12 Fraley R., Subramani S., Berg P., Papahadjopoulos D. J. Biol. Chem., 255, 10431 (1980).

13. Farber F. E., Eberle B. Exp. Cell Res., 103, 15 (1976).

14 Wigler M., Sweet R., Sim G. K., Wold В., Pellicer ?., Lacy E., Maniatis ?.» Silverstein S., Axel R. Cell, 16, 777 (1979).

?2

Глава 1

15. Vuher

страница 13
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2020)