можно, фрагмент эукариотической ДНК следует вырезать из рекомбинантной плазмиды и вновь замкнуть ее в кольцо с помощью ДНК-лигазы. В случае генов, в норме транскрибируемых РНК-полимеразой II, такая процедура помогает избежать транскрипции этой полимеразой, начинающейся с плазмидных промоторов (правда, эта проблема возникает не всегда) [13]. Инъецируется ли замкнутая кольцевая ДНК или ДНК с одноцепочечным разрывом — не имеет значения, поскольку в ядре ооцита есть эффективная система репарации. Хорошей матрицей для транскрипции может служить даже одноцепочечная кольцевая ДНК, поскольку она переходит в двухцепочечную форму в течение 6 ч после инъекции.

3.3. Стабильность инъецированной ДНК

Кольцевая двухцепочечная ДНК, инъецированная в ядро ооцита Xenopus, остается интактной в течение нескольких недель, в то время как при инъекции в цитоплазму, где не происходит транскрипции, она деградирует через 48 ч. Линейная ДНК менее стабильна, чем ее кольцевая форма, независимо от того, где она находится — в цитоплазме или в ядре. Однако ухудшение ее матричных качеств обусловлено не тем, что она в большей степени, чем кольцевая ДНК, подвержена экзо-нуклеазному расщеплению. Обсуждение этих интересных вопросов можно найти в работе [6].

3.4. Концентрация ДНК, используемая

для инъекции

В случае генов, транскрибируемых РНК-полимеразами II или III, максимум интенсивности транскрипции достигается при инъекции примерно 10 нг ДНК на ядро ? [6]. Однако при

70

Глава 2

инъекции в таком количестве рибосомной ДНК (транскрибируемой РНК-полимеразой 1) никакой транскрипции инъецированной ДНК не наблюдается ? [7]. В этом случае, напротив, нужны значительно меньшие количества ДНК: оптимальное количество равно, по-видимому, 25—50 пг ДНК на ядро. Интересно, что при инъекции таких же малых количеств генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II или III, транскрипция отсутствует. Причины этих явлений пока малопонятны1.

3.5. Заполнение микропипеток раствором ДНК

Для заполнения микропипеток ДНК используется тот же метод, что и в случае мРНК (гл. 10, разд. 3.3.2). Он состоит в следующем. Небольшой объем (1—2 мкл) раствора ДНК помещают на полоску парафилма или нескофилма. Микропипетку соединяют со шприцем через гибкую полиэтиленовую трубочку и заполняют парафиновым маслом. Затем, пользуясь стерео-микроскопом, чтобы следить за манипуляциями, микропипеткой набирают раствор ДНК до тех пор, пока граница водный раствор/парафиновое масло не окажется у края поля зрения.

3.6. Микроинъекция

Для микроинъекции ДНК в ядра ооцитов используют главным образом два метода. Применявшийся вначале «слепой» метод (рис. 1,А) состоит во введении ДНК в область ооцита, занимаемую обычно ядром, причем исследователь не видит ядра во время манипуляций. Второй метод, разработанный Бирн-стайлом и др. [16], представляет собой инъекцию в отцентри-фугированные ооциты (рис. \,Б). Во время центрифугирования ядро приближается к поверхности ооцита; его можно увидеть по просветлению пигмента на участке поверхности и инъецировать ДНК прямо в ядро. Мы опишем оба метода.

3.6.1. «Слепой» метод инъекции

Этот метод описан в табл. 2, а на рис. \,А доказаны нормальное положение ядра во время инъекции и его относительные размеры. Очевидно, начинающему исследователю захочется узнать, насколько хорош этот метод инъекции в ядро. Как мне кажется, для тренировочных целей очень подходит следующий прием.

1 Данные о необходимости инъецирования столь малых количеств рДНК. недавно подвергались критике (R. Reeder, личное сообщение).

Экспрессия экзогенной ДНК в ооцитах Xenopus

71

Рис. 1. Методы микроинъекцип в ядро ооцита. А. Положение микропипетки и ооцита при инъецировании ДНК «слепым» методом (разд. 3.6.1). Б. Центрифугирование ооцитов перед микроинъекцией (разд. 3.6.2). Ооциты лежат на нейлоновой сетке, натянутой на дно чашки Петри, причем пигментированная половина каждого ооцита находится сверху. Чашку Петри помещают на дно 1-л стакана ротора с подвесными стаканами для центрифугирования. После центрифугирования чашку Петри вынимают и проводят инъекцию в каждый ооцит, погружая микропнпетку в четко различимое уплощенное ядро. Рисунки предоставлены С. Бамрой.

1. Инъецируйте примерно 50 нл 0,2% -ного трипанового синего в буфере PBS в каждый ооцит, стараясь попасть в ядро.

2. После инъекции перенесите ооциты в модифицированный солевой раствор Барта (гл. 10, табл. 5) в чашку Петри и, пользуясь двумя пинцетами, разделите каждый ооцит на части, делая первый надрыв в вегетативной (непигментированной) половине.

72

Глава 2

Таблица 2. Микроинъекция ДНК и мечение ооцитов

ДНК для инъекции может быть растворена в разных буферах, например в 88 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 10 мМ HEPES (рН 7,4, доведенный КОН) или в 10 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, рН 7,4. Вполне удовлетворительные результаты получаются и при растворении ДНК в дистиллированной воде.

«Слепой метод»

1. Перенесите ооциты на предметное стекло микроскопа, помещенное на большую чашку Петри или другую подходящую посуду, наполненную льдом. Использование такой охлажденной подставки значительно увеличивает выживаемость ооцитов после внутриядерной инъекции.

2. Захватите ооцит часовым пинцетом и поворачивайте его до тех пор, пока верхушка его пигментированной половины не будет находиться под кончиком микропипетки. Продольная ось микропипетки должна быть перпендикулярна экватору, разделяющему пигментированную и желточную полусферы (рис. 1,Л).

3. Введите микропипетку в центр пигментированной области ооцита, следя за тем, чтобы не погрузить ее слишком глубоко. Положение ядра ооцита и его относительные размеры показаны на рис. 1,Л.

4. Если после периода мечения должны быть проанализированы целые не-фракционированные ооциты, то инъецируйте 50 нл раствора ДНК (но не более). Если же после периода мечения ооциты должны быть разделены на ядро и цитоплазму, инъецируйте не более 10 нл ДНК [19]. Чтобы пометить РНК, транскрибированную с инъецированной ДНК, одновременно с ДНК инъецируйте 32Р-нуклеотид (см. разд. 4.1). Можно инъецировать радиоизотоп и через 24 ч после введения ДНК (см. п. 6).

5. После инъекции1 перенесите ооциты на чашки Петри (диаметром 2,5 см), лежащие на льду и содержащие около 5 мл модифицированного солевого раствора Барта, содержащего 10 мкг/мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина2. Проверьте, чтобы ооциты были погружены в раствор, и после выдерживания их в течение 30 мин на льду проинкубируйте при 20 °С.

6. Если РНК, транскрибированная с инъецированной ДНК, должна быть помечена, а меченый 32Р-нуклеотид не был введен вместе с ДНК (п. 4), то инъецируйте его в цитоплазму ооцита (гл. 10, разд. 3.3.3) через 24 ч после инъекции ДНК. Если должны быть помечены белки, кодируемые инъецированной ДНК, то ввести радиоактивную аминокислоту можно двумя способами: и) инъецировать ее в цитоплазму ооцита (гл. 10, разд. 3.3.3) через 24 ч после инъекции ДНК и б) добавить в модифицированный солевой раствор Барта и инкубировать ооциты в ячейке панели для микротитрования в течение 24 ч после инъекции ДНК (гл. 10, разд. 4).

Метод центрифугирования

1. Зафиксируйте хлороформом нейлоновую сетку (размер ячейки 0,8 мм) на дне пластиковой чашки Петри (диаметром 5 см)3.

2. Залейте в чашку Петри ~7 мл модифицированного солевого раствора Барта.

3. Расположите каждый ооцит пигментированной половиной вверх.

4.' Перенесите чашку на плоское дно 1-л стакана ротора с шестью подвес-

ными стаканами от центрифуги MSE Coolspin или аналогичной центрифуги.

5 Отцентрифугируйте при 450—600 g 10 мин при 20 °С. Во время центрифугирования (рис. 1,5) пигментированные гранулы на верхушке ооцита будут смещены поднявшимся ядром, и таким образом мишень для микроинъекций будет легко идентифицироваться (рис. 2).

Экспрессия экзогенной ДНК в ооцитах Xenopus

73

6. После центрифугирования смойте ооциты со дна чашки Петри.

7. Перенесите ооциты на предметное стекло микроскопа на «холодном» предметном столике стереомикроскопа, как описано в п. 1 «слепого» метода.

8. Зажмите каждый ооцит часовым пинцетом и расположите его относительно микропипетки так, как показано на рис. 1,Б.

9. Введите микропипетку в ядро, стараясь не проколоть его насквозь.

10. Если целые ооциты предполагается гомогенизировать и исследовать непосредственно после периода мечения, инъецируйте до 50 нл раствора ДНК. Но если перед анализом препарат ооцитов должен быть разделен на ядерную и цитоплазматическую фракции, инъецируйте только 10 нл раствора ДНК. Следует заметить, что микроинъекцию нужно проводить в течение 45 мин после центрифугирования, поскольку ядра медленно опускаются в глубь ооцита. Чтобы пометить РНК, транскрибированную на инъецированной ДНК, инъецируйте вместе с ДНК 32Р-нуклеотид (см. разд. 4.1). В альтернативном варианте радиоизотоп можно инъецировать через 24 ч после ДНК (см. п. 12).

11. После инъекции1 поместите ооциты в модифицированный солевой раствор Барта и инкубируйте их 24 ч, как описано в п. 5 «слепого» метода.

12. Если должна быть помечена РНК, транскрибированная с инъецированной ДНК, а 32Р-нуклеотид не был введен вместе с ДНК (п. 10), инъецируйте его в цитоплазму ооцита через 24 ч после инъекции ДНК (гл. 10, разд. 3.3.3). Если должны быть помечены белки, кодируемые инъецированной ДНК, то или введите меченую аминокислоту в цитоплазму ооцита (гл. 10, разд. 3.3.3) через 24 ч после инъекции ДНК, или добавьте этот изотоп в модифицированную среду Барта и инкубируйте ооциты в ячейке панели для микротитрования в течение 24 ч после инъекции ДНК (гл. 10, разд. 4).

1 В одной из недавних статей рекомендуется после инъекции погружать ооциты иа 90 мин в раствор 90 мМ фосфата калия (рН, 7,2), 10 мМ NaCl, 1 мМ MgS04 для затягивания ранкн. Однако автор не заметил улучшения результатов при использовании этой методики.

2 Состав модифицированного солевого раствора Барта приведен в табл. 5, гл. 10.

3 Другой тип подложки для центрифугирования можно сделать, разлив по чашкам Петри 1%-ную агарозу в модифицированном солевом растворе Барта слоем 0,2 см и затем прод