ч\
Экспрессия экзогенной ДНК в ооцитах Xenopus 79-
Рис. 4. Анализ РНК ооцитов методом нор-серн-блот-гибридизации. В каждый ооцит инъецировали по 2 нг глобиновой мРНК кролика и выделяли РНК через 0 ч (дорожка 1), 24 ч (дорожка 2) и 48 ч (дорожка 3) после инъекции. Затем проводили электрофорез РНК в 1,5%-ном агарозном геле с формальдегидом, переносили РНК на нитроцеллюлозный фильтр и проводили гибридизацию с глобиновой ДНК, меченной 32Р (табл, 5).
^JJJSJ^ ^???? ^ииви
позволяет обнаруживать транскрипты, которые содержат участки, комплементарные одной из цепей ДНК-зонда, и определять их размеры. При тщательном исполнении этот метод может быть количественным. Пример анализа такого рода приведен на рис. 4.
Если необходимо узнать, какой именно цепи комплементарен транскрипт, то можно использовать одноцепочечные ДНК-зонды. Их получают либо путем электрофореза меченой ДНК-зонда в денатурирующем агарозном геле с последующей элю-цией отдельных цепей ДНК, либо используя одноцепочечную рекомбинантную ДНК колифага М13 в качестве матрицы для синтеза меченой комплементарной цепи ДНК [28].
2. Идентификация 5г-конца РНК-транскриптов. Для идентификации на инъецированном гене области, соответствующей 5'-концу РНК-транскрипта, используют два метода: картирование с помощью Sl-нуклеазы и наращивание затравки.
Принцип Sl-нуклеазного картирования подробно описан в разд. 5.2.1 гл. 5. Здесь возможны два подхода: в первом случае используют немеченую ДНК-зонд для анализа меченых радиоактивных РНК-транскриптов (гл. 3, разд. 3.3), во втором — меченую ДНК-зонд для анализа немеченых РНК-транскриптов. Чаще используется второй метод. Вначале проводят гибридизацию РНК-транскриптов с меченой радиоактивной ДНК-зондом, комплементарной 5'-концу гена и фланкирующей с 5'-конца последовательности. Затем смесь инкубируют с ну-клеазой S1, которая расщепляет только одноцепочечную ДНК,
80
Глава 2
Таблица 5. Норсерн-блот-гибридизация
1. Приготовьте следующие концентрированные растворы: Буфер MOPS для геля
Состав буфера: 1 мМ ЭДТА, 5 мМ ацетат натрия, 20 мМ MOPS (рН 7,0); Этот буфер нужно приготовить в виде растворов с 10- и 14,3-кратной концентрацией:
lOxMOPS-буфер Н.ЗхМОРБ-буфер MOPS 41,9 г 5,93 г
Ацетат натрия 4,1 г 0,58 г
ЭДТА^а2 3,7 г 0,50 г
Н20 до 1 л до 100 мл
Буфер для нанесения Смешайте:
500 мкл деионизованного формамида1 70 мкл 14,ЗхМОР5-буфера
180 мкл профильтрованного формальдегида2 Буфер для гибридизации
50%-ный по объему деионизованный формамид1
50 мМ натрий-фосфатный буфер (рН 6,8)
5XSSC3
0,02%-ный бычий сывороточный альбумин 0,02%-ный поливинилпирролидон 0,02%-ный фикол (мол. масса 400 000)
100 мкг/мл обработанной ультразвуком денатурированной ДНК спермы лосося (Sigma) Буфер для промывки 50 мМ трис-HCl, ? ? 7,6 2 мМ ЭДТА
0,5%-ный пирофосфат натрия (четырехзамещенный) 0,02%-ный бычий сывороточный альбумин 0,02%-ный поливинилпирролидон 0,02%-ный фикол (мол. масса 400 000)
2. Растворите 3 г агарозы в 20 мл lOXMOPS-буфера и 144 мл дистиллированной воды с помощью кипячения. Охладите до 60 °С.
3. Добавьте 36 мл профильтрованного формальдегида2 и вылейте агарозу в стандартную форму для горизонтального геля.
4. Смешайте 5,5 мкл каждой пробы РНК (<20 мкг), растворенной в воде, с 16,5 мкл буфера для нанесения.
5. Прогрейте пробы РНК при 60 °С 5 мин и быстро охладите во льду.
6. Добавьте по 5 мкл глицерола, содержащего 0,05% (вес/объем) бромфено-лового синего, к каждой пробе.
7. Нанесите каждую пробу в отдельную лунку геля и проводите электрофорез при 50 мА, пока бромфеноловый синий не достигнет края геля.
8. Снимите гель и погрузите его в 1%-ный глицин на 60 мин.
9. Если нужно сфотографировать этот гель, добавьте бромистый этидий до концентрации 2 мкг/мл и проведите окрашивание при комнатной температуре 15 мин. Промойте гель три раза дистиллированной водой по 15 мин. Сфотографируйте его в УФ-свете (см. разд. 2.8 работы [27]).
10. Погрузите гель (окрашенный) в 20XSSC на 10—20 мин.
П. Перенесите РНК из геля на нитроцеллюлозный фильтр (Schleicher and
Sehuell, ВА85), используя стандартный метод переноса по Саузерну (см.
работу [26] и разд. 2.10 в работе [27]). Буфер для переноса — 20XSSC.
12. После переноса прогрейте фильтр в течение 2 ч при 80 °С.
13. Проведите предгибридизацию в гибридизационном буфере не менее 8 ч при 42 "С в заплавленном пластиковом пакете.
Экспрессия экзогенной ДНК в ооцитах Xenopus
81
14. Удалите гнбридизационный буфер и замените его следующей смесью:
4 объема свежего буфера, 1 объем 50%-ного (вес/объем) декстрансульфа-та (мол. масса 500 000, Sigma) и 0,1 объема денатурированной (100 °С,
5 мин) меченой ДНК-зонда. Проведите гибридизацию в течение ~20 ч пои 42 °С.
15. Промойте фильтр 4 раза при комнатной температуре 2XSSC, 0,1%-ным ДСН (каждая промывка 5 мин), затем 2 раза при 50°С 0.1XSSC, 0,1%-ным ДСН (каждая промывка 15 мин).
16. Заверните сырой фильтр в специальную пленку Saran или какую-либо^ другую тонкую пленку и экспонируйте с ним рентгеновскую пленку при> —70 °С с усиливающим экраном, содержащим вольфрамат кальция (например, Fuji Mach 2 или DuPont Cronex Lightning Plus).
Один фильтр можно использовать повторно с разными ДНК-зондами для обнаружения других РНК-транскриптов. Для этого следует удалить меченый зонд с фильтра, промыв его в (0,05—0,1)Хбуфере для промывки при 65 °С 1—2 ч, затем провести предгибридизацию и проинкубировать его с другой меченой ДНК-зондом, как описано выше.
Деионизованный формамнд получают следующим образом. Втряхивайте 100 » формамида с 5 г ионообменной смолы (например, Amberlite MB3) 30 мин при комнатной температуре. Профильтруйте формамид и храните его порциями при —20 °С , ilJ%%^ использованием профильтруйте формамид через обеззоленный фильтр
1XSSC — это 0,15 ? NaCl, 15 мМ цитрат (трехзамещенный)
Таблица 6. Картирование 5'- и З'-концов РНК-транскриптов с помощью нуклеазы S1
1. Осадите этанолом (табл. 3, пп. 8 и 9) и меченую ДНК-зонд, и РНК-транскрипт.
2. Растворите каждый осадок в небольшом объеме буфера для гибридизации1 (1 мМ ЭДТА, 0,4 ? NaCl, 80%-ный деионизованный формамид, 40 мМ PIPES, рН 6,4).
3. Смешайте 5 мкл (20 мкг) РНК с 2 мкл (—100 нг) ДНК-зонда.
4. Перенесите смесь в стеклянный капилляр и на огне заплавьте оба конца.
5. Проинкубируйте капилляр при 80 °С 10 мин и сразу, не дав остыть, перенесите его в температуру 52 "С. Проинкубируйте при 52 °С 5 ч.
6. После гибридизации смешайте 1 мкл нуклеазы S1 (~1000 ед/мкл, Sigma) с 900 мкл буфера для S1 (0,28 ? NaCl, 4,5 мМ ZnS04, 20 мкг/мл обработанной ультразвуком денатурированной ДНК спермы лосося, 50 мМ ацетат натрия, рН 4,6). Разделите раствор на аликвоты по 150 мкл.
7. Перенесите содержимое одной капиллярной трубочки (п. 5) в аликвоту буфера с нуклеазой S1 объемом 150 мкл (п. 6).
8. Проинкубируйте при 37 °С 30 мин.
9. Остановите реакцию добавлением 6 мкл 0,2 ? ЭДТА.
10. Проведите экстракцию одним объемом смеси фенол — хлороформ (1:1) и осадите этанолом нуклеиновую кислоту из водной фазы (табл. 3, пп. 8 и 9).
11. Ресуспендируйте осадок в 2 мкл воды и проведите анализ нуклеиновой кислоты.в полиакриламидном «секвенирующем» геле (см. разд. 3 работы [29] и гл. 5, табл. 10).
1 Этот буфер готовят, растворяя 1.2 г PIPES и 2,3 г NaCl в 10 мл 10 мМ ЭДТА и 80 мл деионизоваииого формамида (см. табл. 5, сноску I). Это занимает около 15 мин Доведите рН до 6,4 концентрированным NaOH и затем добавьте дистиллированную воду до конечного объема 100 мл.
?-953
82
Глава 2
1 2
Рис. 5. Sl-нуклеазное картирование РНК ооцитов. Рекомбинантную ДНК, содержащую tk-тея вируса простого герпеса, инъецируют в ооциты и через 24 ч выделяют из них РНК. РНК гибридизируют с ДНК-зондом, меченной по 5'-концу дистальнее ^-промотора. Получившийся гибрид обрабатывают нуклеазой S1, денатурируют и анализируют методом электрофореза в 12%-ном полиакриламидном «секвенирующем» геле (табл. 6). Длина основного защищенного фрагмента (дорожка 1) равна 95 оснований; это означает, что 5'-ко-нец основного транскрипта находится на расстоянии 95 bp левее меченого 5'-конца зонда. Дорожка 2 —контроль; в этом опыте была взята РНК, выделенная из ооцитов после инъекции в них воды. Указаны также размеры (в bp) соответствующих маркерных фрагментов ДНК.
но не ДНК в составе гибридов; устойчивой к расщеплению будет только часть молекулы ДНК-зонда, гибридизовавшаяся с РНК-транскриптом. Далее с помощью электрофореза в геле определяют размеры устойчивого к нуклеазе фрагмента^ ДНК. Соотнося размеры этого фрагмента с размерами исходной ДНК-зонда, можно идентифицировать в пределах ДНК-зонда сайт,
Экспрессия экзогенной ДНК в ооцитах Xenopus
83;
Таблица 7. Картирование 5' и З'-концов РНК-транскриптов методом наращивания затравки
1. Приготовьте короткий фрагмент (30—80 bp) ДНК, соответствующий последовательности вблизи предполагаемого сайта кэпирования изучаемого-гена. Пометьте 5'-концы, используя Т4-полинуклеотидкиназу и [у-32Р]-АТР, и затем отделите одиночные цепи, комплементарные РНК-транскрипту, путем электрофореза в денатурирующем «секвенирующем» геле (гл. 5, табл. 10). В идеале, чтобы облегчить разделение цепей, нужно выбрать такие ферменты рестрикции для получения фрагмента ДНК, чтобы комплементарные цепи имели разную длину.
2. Смешайте:
1—3 мкл ДНК-затравки с меченым 5'-концом
2 мкл 5-кратного гибридизационного буфера (2 ? NaCl, 50 мМ PIPES, рН 6,4)
5—10 мкг суммарной РНК (табл. 3, п. 9) дистиллированную воду до 10 мкл
3. Проведите гибридизацию в запаянном ст
