Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

анной ДНК. В этих опытах совместная инъекция ДНК и различных белковых фракций, получаемых в процессе разделения, была использована для идентификации^ очистки активных регуляторных белков. Ясно, что система ооцитов Xenopus еще не исчерпала всех своих возможностей при изучении транскрипции.

Литература

1. Meriz J. ?., Gurdon J. В. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1502 (1977).

2. Colman A. Eur. J. Biochem., 113, 339 (1975).

3. Gurdon J. В., Brown D. D. Dev. Biol., 67, 346 (1978).

4. Kressmann ?., Birnstiel M. L. In: Transfer of Cell Constituents into Eukaryotic Cells, Celis J., Graessmann A. and Loyter A. (eds.), Plenum Press, New York, p. 383, 1980.

5. Wickens M. P., Laskey R. A. In: Genetic Engineering, vol. I, Williamson R. (ed.), Academic Press Inc., New York and London, p. 103, 1981.

6. Gurdon J. В., Melton D. A. Annu. Rev. Genet., 15, 189 (1981).

7. Moss T. Cell, 30, 835 (1982).

8. Rungger D., Turler H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 6073 (1978).

9. De Robertis E., Mertz J. Cell, 12, 175 (1978).

88

Глава 2

10. Lasky R. ?., Honda ?. ?., Mills ?. ?., Morris ?. R., Wyllie ?. ?., Mertz J., De Robertis ?., Gurdon J. В. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 42, 171 (1978).

11. Asselbergs F. A. M., Smart J. E., Mathews ??. В. J. Mol. Biol., 163, 209· (1983).

12. Probst E., Kressmann ?., Birnstiel M. L. J. Mol. Biol., 135, 709 (1979).

13. Old R. W., Woodland H. R., Ballantine J. E. M„ Aldridge Т. C., Newton C. ?., Bains W. ?., Turner P. C. Nucleic Acids Res., 10, 7561 (1982).

14. McKnight S. L., Garvis E. R. Nucleic Acids Res., 8, 5931 (1980).

15. Wickens M. P., Woo S., O'Malley B. W., Gurdon J. B. Nature, 285, 628 (1980).

16. Kressmann ?., Clarkson S. G., Pirotta V., Birnstiel M. L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1176 (1978).

17. Melton D. ?., Cortese R. Cell, 18, 165 (1979).

18. Grosschedl R., Birnstiel M. L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1432 (1980).

19. Wickens M. P., Gurdon J. B. J. Mol. Biol., 163, 1 (1983).

20. McKnight S., Kingsbury R. Science (Wash.), 217, 316 (1982).

21. Grosschedl R., Birnstiel M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7102 (1980).

22. Trendelenburg M. F., Gurdon J. B. Nature, 276, 292 (1978).

23. Bogenhagen D. F., Brown D. D. Cell, 24, 261 (1981).

24. Bogenhagen D. F., Sakonju S., Brown D. D. Cell, 19, 27 (1980).

25. Woodland H., Pestell R. Biochem. J., 127, 597 (1972).

26. Thomas P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5201 (1980).

27. Sealey P. G., Southern ?. M. In: Gel Electrophoresis of Nucleic Acids — A Practical Approach, Rickwood D. and Hames B. D. (eds.), IRL Press, Oxford and Washington DC, p. 39, 1982.

28. Messing J. In: Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA, Walton A. (ed.); Elsevier, Amsterdam, p. 143, 1981.

29. Dauies R. W. In: Gel Electrophoresis of Nucleic Acids A Practical Approach, Rickwood D. and Hames B. D. (eds.), IRL Press, Oxford and Washington DC, p. 117. 1982.

30. Green M., Maniatis Т., Melton D. Cell, 32, 681 (1983).

31 Jones N.. Richter J., Weeks D., Smith L. J. Mol. Biol. (1983), in press. 32. Stunnenberg H., Birnstiel M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6201 (1982).

ГЛАВА 3

ТРАНСКРИПЦИЯ ГЕНОВ ЭУКАРИОТ В БЕСКЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТАХ

Дж. Мэнли 1. Введение

В эукариотических клетках идентифицированы ядерные ДНК-зависимые РНК-полимеразы трех классов [1]. РНК-полимераза I катализирует синтез предшественников рибосомной РНК (рРНК), РНК-полимераза II транскрибирует преимущественно гены, кодирующие информационную, или матричную, РНК (мРНК), а транскрипция РНК-полимеразой III приводит к образованию транспортных РНК (тРНК), 5S-PHK и некоторых других небольших РНК с неизвестной функцией. Уже давно стало ясно, что для изучения механизмов транскрипции, а также для идентификации факторов и нуклеотидных последовательностей, регулирующих генную экспрессию, потребуются бесклеточные системы, в которых точно и специфично транскрибируется экзогенная ДНК. В ранних работах этого направления использовали очищенные РНК-полимеразы, что не привело к успеху. Однако в последние годы разработаны бесклеточные системы, в которых удается проводить точную транскрипцию при участии РНК-полимераз всех трех типов. Плодотворными оказались два основных подхода. В одном случае к очищенной РНК-полимеразе добавляют бесклеточные экстракты, содержащие факторы, необходимые для точной транскрипции [2]. Этот метод достаточно трудоемок, поскольку получать в больших количествах очищенную активную РНК-полимеразу не так просто. Другой подход заключается в получении концентрированных клеточных экстрактов, содержащих не только факторы, необходимые для транскрипции, но и достаточные количества РНК-полимеразы, так что здесь добавления очищенного фермента не требуется. Для РНК-полимераз I [3] и III [4] такие системы можно просто получить из цитоплазматических экстрактов, поскольку большие количества этих полимераз и необходимые для них факторы выходят из ядра при гипотонических концентрациях соли. В то же время РНК-полимераза II при этом почти полностью остается внутри ядра. Поэтому экстракты, содержащие этот фермент, необходимо готовить из целых клеток [5]. Способ получения и свойства экстракта, содержащего все факторы и ферменты, необходимые для точной и специфической транскрипции РНК-полимеразами I, II и III и для полиаденилирования предшественников мРНК, описаны ниже.

90

Глава 3

До настоящего времени в большинстве экспериментов использовали экстракты, выделенные из человеческих клеток, растущих в суспензии (HeLa или КВ-клетки). Такие экстракты имеют очень широкую видоспецифичность в отношении РНК-полимераз II и III. В экстрактах из клеток HeLa точно транскрибируются гены практически всех проверенных высших эукариот, считываемые РНК-полимеразой III. В бесклеточных экстрактах из целых клеток не обнаружена точная транскрипция генов дрожжей РНК-полимеразой II, но было показано, что в них происходит транскрипция генов фиброина шелка Bombyx tnori [6] и кональбумина цыпленка [7], а также многих других генов высших эукариот и вирусов эукариот.

Конечно, для синтеза зрелых молекул РНК требуются дополнительные ферменты и факторы, отличающиеся от факторов, необходимых для точной инициации транскрипции, например ферменты, осуществляющие процессинг РНК. Экстракты клеток HeLa, по-видимому, содержат практически все ферменты, нужные для процессинга тРНК, в том числе ферменты сплайсинга пре-тРНК [8]. Эксперименты на системах с РНК-полимеразой I только начинаются, но уже есть указания на то, что соответствующие экстракты содержат по крайней мере один фермент для процессинга предшественников рРНК ;[9, 10]. Наконец, транскрипты, синтезируемые в бесклеточных экстрактах РНК-полимеразой II, кэпируются и метилируются по 5'-концам [2, 5], и недавно разработаны условия для эффективного и точного полиаденилирования предшественников мРНК [И]. Тем не менее, хотя в нескольких работах высказывается предположение о сплайсинге новообразованной РНК [12—14], наблюдавшаяся активность, ответственная за этот процесс, была низка и сплайсинг достоверно не воспроизводился.

В растворимых транскрипционных системах в бесклеточных условиях может воспроизводиться ряд этапов, необходимых in vivo для синтеза зрелой РНК (см. обзор [15]). Эти системы используются для идентификации и характеристики факторов, необходимых для синтеза РНК, идентификации нуклеотидных последовательностей, регулирующих генную экспрессию, и для выяснения механизмов регуляции генной экспрессии.

2. Получение и использование бесклеточного экстракта для транскрипции РНК-полимеразой II

2.1. Получение экстракта

Экстракты получают несколько модифицированным методом Сагдена и Келлера которые использовали его в качестве

первой стадии очистки РНК-полимеразы. Они работали с клет-

Транскрипция генов эукариот в бесклеточных экстрактах

91

Таблица 1. Приготовление бесклеточных экстрактов из целых клеток

1. Нарастите клетки HeLa (2—25 л) до плотности 4—8-Ю5 клеток/мл в суспензионных культурах на минимальной среде Игла с добавлением 5 /0 лошадиной сыворотки. По-видимому, плотность клеток не имеет особого значения; правда, отмечено, что наиболее активные экстракты были получены с клетками, собранными на нижней границе указанных пределов плотности. Описанные ниже процедуры проводите при 0—4 °С.

2. Отцентрифугируйте клетки при 1000 g- 15 мин и промойте их дважды солевым раствором] забуференным фосфатным буфером.

3. Ресуспендируйте клетки в 4-кратном по сравнению с клеточным осадком растворе 10 мМ трис-HCl, рН 7,9, 1 мМ ЭДТА и 5 мМ ДТТ (6-Ю8 клеток соответствуют приблизительно 2 мл осадка клеток). На этой стадии

клетки должны заметно набухнуть.

4. Через 20 мин лизируйте клетки путем гомогенизации в гомогенизаторе Даунса восемью движениями пестика типа «В».

5 Добавьте 4-кратный по сравнению с клеточным осадком объем 50 мМ трис-HCl, рН 7,9, 10 мМ MgCl2, 2 мМ ДТТ, 25%-ной (вес/объем) сахарозы и 50% -ного глицерола и осторожно перемешайте суспензию. Продолжая слегка потряхивать суспензию, добавьте по каплям насыщенный (нейтрализованный) раствор сульфата аммония в объеме, равном объему осадка клеток. После этого еще 30 мин осторожно перемешивайте этот лизат, обладающий высокой вязкостью. Перемешивайте очень осторожно, чтобы не допустить дробления ДНК; в противном случае будет трудно отделить ее на следующем этапе. После добавления приблизительно половины нужного объема сульфата аммония вязкость увеличится, что указывает на лизис ядер. Обычно лизаты очень вязки и гомогенны, но иногда они содержат комочки и не обладают высокой вязкостью. Мы получали активные экстракты из лизатов обоих типов, причем более стабильно —из лизатов первого типа. Доля активных экстрактов, приготовленных таким способом, составляет 80%.

6. Осторожно перелейте экстракт в поликарбонатные пробирки и центрифугируйте при 175 000 g 3 ч (например, в роторе Beckman 50.2 при 45 000 об/мин).

7. Слейте супернатант так, чтобы не повредить осадок (оставьте над ним 1—2 мл) и осадите белок и нуклеиновую ки

страница 20
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.09.2019)