нскрипции, обычно используют 0,25 мкг ДНК-зонда размером -~5 kb. Для фрагментов РНК, больших по размерам, берут пропорционально большие, а для меньших — соответственно меньшие количества ДНК. Такое количество ДНК избыточно по сравнению с малым количеством РНК, синтезированной в стандартной реакции транскрипции, и в то же время оно достаточно для проведения реакции гибридизации до конца в течение короткого периода времени. Добавьте в микроцентрифужную пробирку, содержащую 100 мкл 0,2 ? ацетата натрия, рН 5,2, 0,1% ДСН, ДНК-зонд и 32Р-РНК (без примесей ДНК; табл. 4). К этой смеси добавьте 2,5 объема этанола, перемешайте и оставьте в спирте с сухим льдом на 5 мин (или при —20 °С минимум на 2 ч), чтобы нуклеиновые кислоты выпали в осадок.

2. Отцентрифугируйте осадок нуклеиновых кислот 5 мин на микроцентрифуге в холодной комнате (4°С). Осторожно слейте этанол и затем дайте осадку высохнуть на воздухе в течение приблизительно 10 мин. Важно не пересушить осадок, иначе его будет трудно растворить.

3. Ресуспендируйте пробу в 15 мкл буфера для гибридизации (80%-ный деионизованный формамид2, 0,4 ? NaCl, 1 мМ ЭДТА, 40 мМ PIPES, рН 6,5).

4. Денатурируйте ДНК-зонд прогреванием при 68 °С 10 мин и затем быстро перенесите пробирку в баню на 60 °С. Инкубируйте 45 мин при данной температуре; в течение этого времени происходит гибридизация3.

5. После гибридизации быстро разбавьте реакционную смесь 200 мкл охлажденной во льду смеси с нуклеазой S1 [0,25 ? NaCl, 1 мМ ZnS04, 5%-ный глицерол, 30 мМ ацетат натрия, рН 4,5, 2-Ю3 ед./мл нуклеазы' SI (Boehringer)]. Когда анализируют сразу несколько проб, их по одной снимают с инкубации при 60 °С, разбавляют смесью с нуклеазой S1 и перемешивают. Такая обработка предотвращает реассоциацию ДНК — ДНК и возможное вытеснение гибридизовавшейся РНК-

6. Инкубируйте каждую пробу при 45 °С 30 мин; во время этой инкубации происходит расщепление нуклеазой S1.

7. После расщепления добавьте в каждую пробу 0,2 мл смеси фенол — хлороформ (1:1, по объему) и затем 10 мкг тРНК-носителя. Смеси перемешайте и отцентрифугируйте на микроцентрифуге 30 с.

8. После центрифугирования перенесите водную (верхнюю) фазу в чистую микроцентрифужную пробирку и осадите нуклеиновые кислоты 0,5 мл этанола, инкубируя пробы в спирте с сухим льдом 5 мин (или минимум 2 ч при — 20 °С).

9. Отцентрифугируйте осадок нуклеиновых кислот на микроцентрифуге 5 мин в холодной комнате (4°С).

10. Высушите каждый осадок и растворите его в 15—60 мкл 1 мМ ЭДТА, 0,2%-ного саркозила. При необходимости пробы храните при —20 °С.

11. Всю пробу или ее часть можно обработать глиоксалем и защищенные от нуклеазы фрагменты РНК проанализировать с помощью электрофореза в агарозном геле, как описано в табл. 3.

1 Основано на методе Берке и Шарпа [21].

2 Деионизуйте формамид, встряхивая его со смолой Amberlite МВ-3 (5 г на 100 мл формамида) при комнатной температуре минимум 30 мин.. Удалите смолу фильтрованием и храните формамид прн —20 °С. Приготовленный таким образом формамид в эти> условиях остается стабильным минимум 6 мес.

3 Зд«сь приведены время и температура гибридизации для ДНК аденовируса 2 Соответствующие условия для других зондов можно определить по Берку и Шарпу [21J'

Транскрипция генов эукариот в бесклеточных экстрактах_101

Для определения точки начала транскрипции in vitro с помощью нуклеазы S1 ДНК-зондом должен служить фрагмент рестрикции геномной ДНК, один конец которого соответствует внутренней области гена, а другой — участку ДНК перед предполагаемым сайтом инициации. Обычно после гибридизации и расщепления нуклеазой S1 РНК-транскрипты обрабатывают глиоксалем и затем определяют их размеры путем электрофореза в агарозном геле (табл. 5, п. 11). Лучшее разрешение получают при использовании меченой радиоактивной ДНК-зонда и немеченных РНК-транскриптов (как описано в гл. 5, разд. 5), поскольку иногда легче получить соответствующие маркерные ДНК, чем маркерные РНК (молекулы ДНК и РНК с одинаковой длиной цепи мигрируют не абсолютно одинаково). Тем не менее использование меченых радиоактивных РНК-транскриптов и немеченой ДНК-зонда, описанное в табл. 5, имеет два преимущества. Во-первых, синтезировать радиоактивную РНК in vitro так же легко, как немеченую РНК, и, таким образом, убирается дополнительный этап мечения. Во-вторых, в некоторых случаях желательно анализировать непосредственно РНК-транскрипт. Например, если РНК-продукт, образующийся в системе in vitro, присутствует в бесклеточном экстракте и в виде эндогенной мРНК, то необходимо анализировать меченую радиоактивную РНК-

4. Оптимизация транскрипционной активности РНК-полимеразы II

4.1. Подбор концентраций ДНК и экстракта

Зависимость транскрипции и от концентрации ДНК, и от концентрации экстракта не линейна. При измерении уровня прерванной транскрипции как функции концентрации ДНК при постоянной концентрации экстракта выявляется следующее. Во-первых, существует пороговая концентрация ДНК, ниже которой транскрипция отсутствует, и, во-вторых, ДНК в высоких концентрациях ингибирует процесс транскрипции [5]. Чтобы обеспечить минимальную (пороговую) концентрацию ДНК, необходимую для транскрипции, можно использовать ДНК-носитель, отличающуюся от ДНК, которая должна быть транскрибирована. Так, например, промотор-специфическая ДНК, присутствующая в концентрации ниже пороговой, активно транскрибируется в присутствии ДНК pBR322 или Е. coli. ДНК-носителем могут служить и синтетические дуплексы, представляющие собой чередующиеся сополимеры poly (dIC : dIC) и poly(dAT: dAT). Это указывает на то, что потребность в массе ДНК не связана с потребностью в специфических последовательностях [22]. Преимущества использования таких сопо-

1 2 3 4 ......t '2 .....3 4 5 ? 7,..........и1М

Рис. 3. Определение оптимальных концентраций экстракта и ДНК, необходимых для точной транскрипции. РНК была синтезирована в стандартных реакционных смесях с использованием [a-32P]-UTP (разд. 2.2), где варьировали только концентрацию бесклеточного экстракта (А) или ДНК (Б). ДНК-матрицей служил фрагмент 6a//-E-pBR322 (см. подпись к рис. 2). Положения специфического транскрипта (1750 нуклеотидов) указаны стрелками. В реакциях, представленных на рис. 3, А, количество использованного бесклеточного экстракта на дорожках 1—4 было 2,5 мкл, 5,0 мкл, 10,0 мкл и 15,0 мкл соответственно при концентрации ДНК 50 мкг/мл. На рис. 3,5 использованные концентрации ДНК на дорожках 1·—7 были (мкг/мл) : 0 12,5; 25,0; 50,0; 75,0; 100,0 и 125,0 соответственно. На дорожку ? в качестве маркера молекулярной массы наносили .EcoRI-гидролизат ДНК аденовируса 2 после мечения путем ник-трансляции.

Транскрипция генов эукариот в бесклеточных экстрактах__103

лимеров в роли ДНК-носителя заключаются в том, что РНК-продукты, транскрибированные на poly(dIC : dIC) и poly(dAT: :dAT), содержат только два нуклеотида. Следовательно, если в реакции с poly (dIC : dIC) участвует [a-32P]-UTP, то исключается образование радиоактивного фонового продукта в результате неспецифического считывания с носителем. Важнейшим моментом в понимании зависимости транскрипции от массы ДНК является тот факт, что при фиксированной концентрации суммарной ДНК молярный выход транскриптов в расчете на промотор является постоянным и не зависит от источника ДНК-носителя.

Наблюдается также критическая зависимость транскрипции от концентрации экстракта [б]. В действительности зависимость от концентрации ДНК и от концентрации белка в экстракте связаны между собой [23]. Специфическую транскрипцию регистрируют при конечной концентрации белка экстракта в реакционной смеси в пределах 4—18 мг/мл. При низких значениях этого диапазона пороговая концентрация ДНК ниже и процесс транскрипции становится менее зависимым от абсолютной концентрации ДНК. Оптимум концентрации ДНК приблизительно равен 10 мкг/мл. При более высоких концентрациях экстракта пороговая концентрация ДНК настолько увеличивается, что в некоторых случаях, чтобы зарегистрировать какую-либо транскрипцию, приходится доводить концентрацию ДНК до 60 мкг/мл. ?? этих условиях транскрипция становится более зависимой от абсолютной концентрации ДНК. Чтобы найти оптимальные условия, для каждого нового экстракта нужно тщательно подбирать концентрации ДНК и экстракта. Типичный пример такого подбора показан на рис. 3. При очень низких концентрациях экстракта может наблюдаться высокий уровень неспецифической транскрипции (ср. дорожки 1 и 4 на рис. 3, Л). Вероятно, это связано с тем, что в данных условиях лимитирован необходимый фактор специфичности. При высоких концентрациях ДНК уровень специфической инициации снижается и образуются транскрипты, размер которых больше и меньше по сравнению с промотор-специфическим транскриптом (показано стрелкой; ср. дорожки 4—7 на рис. 3,Б). Транскрипты большего размера образуются в результате транскрипции линейной ДНК-матрицы, участки которой соединены конец-в-ко-нец, а происхождение транскриптов меньшего размера не известно [5].

4.2. Различия между экстрактами

Транскрипционная активность экстрактов, выделенных из разных клеточных препаратов, различается в 5—10 раз, причем две трети экстрактов обладают активностью, не более чем

104

Глава 3

вдвое отличающейся от максимальной. Активность экстрактов необходимо сравнивать, пользуясь системой прерванного синтеза, содержащей стандартный промотор полимеразы II, например главный поздний промотор аденовируса 2. При оптимальных концентрациях ДНК и экстракта (разд. 4.1) и удельной радиоактивности [a-32P]-UTP 100 Ки/ммоль хороший экстракт (в объеме 25 мкл) дает включение 106 расп/мин за 1 ч, что эквивалентно синтезу 20 нг прерванного транскрипта размером 2200 нуклеотидов, инициированного с позднего промотора аденовируса 2. Это означает синтез одной молекулы РНК на 10 молекул имеющейся ДНК-матрицы, хотя в действительности в экстракте может использоваться только часть имеющихся матриц, на которых многократно проходят циклы инициации.

4.3. Условия реакции 4.3.1. Температура

Одна из характерных особенностей процесса транскрипц