ии в системе бесклеточного экстракта заключается в его необычной, неаррениусовской зависимости от температуры. Как правило, транскрипцию проводят при 30 °С, и синтезированная РНК остается стабильной минимум 8 ч. С повышением температуры до 37°С значительно увеличивается скорость деградации РНК- Так, РНК, синтезированная при 30 °С, при 37 °С деградирует в течение 10 мин. Транскрипция, происходящая при 25 °С, дает ожидаемый эффект Аррениуса.

4.3.2. Ионный состав

Специфическая транскрипция в бесклеточном экстракте очень чувствительна к ионной силе. КС1 или NaCl в концентрации выше 60 мМ значительно ингибируют реакцию, а при концентрации этих солей 120 мМ и выше специфическая транскрипция практически прекращается. Реакция идет в присутствии 15—30 мМ (NH4)2S04. Дивалентные катионы Zn2+, Са2+ или Мп2+ ингибируют транскрипцию. Чтобы предотвратить возможное ингибирование примесями тяжелых металлов, обычно в реакционную смесь добавляют ЭДТА до конечной концентрации 0,2 мМ.

4.3.3. рН

Реакции транскрипции обычно проводят при рН 7,9, что является оптимальным для очищенной РНК-полимеразы II [1]. Однако для специфической транскрипции этим ферментом в бесклеточной системе резко выраженный оптимум рН не обнаружен.

Транскрипция генов эукариот в бесклеточных экстрактах

105

4.3.4. Нуклеотиды

Даже после тщательно проведенного диализа большинство бесклеточных экстрактов, по-видимому, содержат свободные нуклеотиды (около 1 мкМ) [23]. Обычно для восстановления содержания нуклеозидтрифосфатов в реакционную смесь добавляют 4 мМ креатинфосфат, что позволяет снизить концентрации трифосфатов и, следовательно, увеличить удельную радиоактивность добавляемого радиоактивного нуклеотида. В присутствии креатинфосфата концентрации UTP, СТР и GTP, равные 5 мкМ, являются насыщающими для специфической транскрипции, причем более высокие концентрации (до 500 мкМ) не ингибируют ее ,[24]. Благодаря эндогенному пулу реакция транскрипции не абсолютно зависит от добавления этих трех нуклеотидов. Для оптимальной активности необходима более высокая концентрация АТР (50 мкМ), но концентрации АТР свыше 200 мкМ ингибируют реакцию [23].

5. Посттранскрипционный процессинг молекул — предшественников мРНК

5.1. Кэпирование и метилирование

Отдиализованный бесклеточный экстракт содержит достаточное количество S-аденозилметионина для метилирования 5'-концов предшественников мРНК, синтезируемых РНК-полимеразой II [5]. Новосинтезированная РНК быстро и количественно кэпируется с образованием структуры типа кэп I [m7GpppX(m)pY], тогда как структуры типа кэп II [m7GpppX(m)pY(m)pZ] не обнаружены [25]. Внутреннее метилирование пока не изучалось. Экзогенный S-аденозилметионин не влияет на процесс транскрипций [17, 26], а S-аденозилгомоцистеин ингибирует инициацию специфической транскрипции РНК-полимеразой II [26].

5.2. Сплайсинг

В бесклеточных лизатах, подобных (или идентичных) системе, описанной в этой главе, сплайсинг мРНК наблюдали только на низком уровне, причем результаты этих наблюдений воспроизвести не удалось [12—14]. Однако исследования в этом направлении продолжают расширяться, и ситуация, по-видимому, разъяснится в ближайшем будущем.

5.3. Полиаденилирование

В результате транскрипции экзогенной ДНК в бесклеточных экстрактах в условиях, описанных в разд. 2.2, синтезируются молекулы РНК, не полиаденилированные на заметном

106

Глава 3

уровне. Однако в последнее время найдены условия, позволяющие эффективно, точно и специфически полиаденилировать экзогенные предшественники мРНК в бесклеточном экстракте, полученном из клеток HeLa [11]. Предшественники мРНК синтезируют на линейных ДНК-матрицах при стандартных условиях реакции (разд. 2.2) и затем очищают по методу, приведенному выше (табл. 2). 60 мкл РНК, полученной в стандартной реакции транскрипции (табл. 2, п. 10), осаждают этанолом, лиофилизуют и растворяют в 50 мкл стерильной дистиллированной воды, причем удалять примеси ДНК из этого раствора не обязательно. Затем РНК инкубируют во второй пробе свежего бесклеточного экстракта в условиях полиаденилиро-вания. В состав стандартной смеси для реакции полиаденили-рования (объем 25 мкл) входят:

5 мкл бесклеточного экстракта

10 мкл РНК-транскриптов

0,1—0,5 мМ АТР

4,0 мМ креатинфосфат

0,5 мМ ЭДТА.

Каждую реакционную смесь инкубируют при 30 °С 60 мин и затем выделяют РНК обычным методом (табл. 2). Уровень полиаденилирования РНК определяют или методом аффинной хроматографии РНК на oligo(dT)-целлюлозе [27], или с помощью электрофореза в геле после обработки глиоксалем (табл. 3).

На рис. 4 изображен пример определения уровня полиаденилирования РНК, синтезированной in vitro, с помощью электрофореза. В качестве матрицы первоначально была использована рекомбинантная плазмида, которая содержала поздний промотор аденовируса 2 и последовательности SV40, кодирующие Т-антиген. ДНК была разрезана эндонуклеазой ВатИХ в районе, расположенном на 45 bp после сайта добавления poly (А), используемого in vivo. Длина добавленного poly (А) -фрагмента (дорожка 2) составляла 150—300 нуклеотидов.

Условия, необходимые для полиаденилирования в бесклеточном экстракте, должны точно соблюдаться так же, как и условия, необходимые для инициации специфической транскрипции, хотя в этих двух случаях условия совершенно различны. Например, полиаденилирование резко ингибируется при концентрациях моновалентных катионов выше 30 мМ, а дива-лентных катионов выше 4 мМ. Для него необходима также некая минимальная концентрация РНК. Как и в случае инициации транскрипции, потребность в РНК — это, по-видимому, потребность в общей массе РНК, а не в специфических последовательностях РНК- Таким образом, приступая к изучению лолиаденилирования пре-мРНК in vitro, нужно подобрать кон-

Транскрипция генов эукариот в бесклеточных экстрактах_107

1 2 3 4 5 6

Рис. 4. Характеристика прерванных РНК-транскриптов после полиаденилирования. Прерванные РНК-транскрипты были синтезированы в системе с бесклеточным экстрактом на BamHI-фрагменте flHKp0 4-SVA, после чего они были очищены и добавлены в смесь для полиаденилирования, как описано в тексте. После экстракции и обработки глиоксалем РНК была проанализирована методом электрофореза в 1,2%-ном агарозном геле. Дорожка 1—прерванные РНК-транскрипты перед полиаденилированием; дорожка 2 —РНК, проинкубированная в полиадеиилирующей реакционной смеси, как_описано в тексте; дорожка 3 — РНК, проинкубированная в полиадени-лирующей реакционной смеси без АТР; дорожка 4 — РНК, проинкубированная в полиадеиилирующей реакционной смеси без экстракта, но с добавлением соответствующего объема буфера для диализа; дорожка 5 —- то же, что и дорожка 2, но с уменьшенным на 50% количеством добавленной РНК; дорожка 6 — то же, что и дорожка 3, но количество добавленной РНК уменьшено на 80%. На дорожках 1—4 количество проанализированной РНК было эквивалентно 20%, на дорожке 5—40% и на дорожке 6—100% содержания РНК в полиадеиилирующей реакционной смеси.

10S

Глава 3

центрации экстракта и РНК, оптимальные для проведения реакции; при этом полезно использовать приведенные выше значения как ориентировочные. При оптимальных условиях поли-аденилируется более 70% молекул-предшественников, а размеры добавляемого poly (А)-фрагмента, так же как и in vivo, составляют 150—300 нуклеотидов. Реакция элонгации, по-видимому, идет непрерывно, и скорость элонгации относительно велика. При субоптимальных условиях уменьшаются и доля полиаденилируемой РНК-предшественника, и размеры добавляемого poly (А)-фрагмента.

Реакция полиаденилирования in vitro обладает поразительной, специфичностью: эффективно полиаденилируется только тот предшественник мРНК, синтезированный in vitro, З'-конец которого расположен рядом с аутентичным сайтом добавления poIy(A) in vivo1). Таким образом в исследованиях реакции полиаденилирования полезно предварительно определять, способны ли быть субстратами в этой реакции молекулы РНК, которые были синтезированы на ДНК-матрицах, разрезанных различными рестриктазами. Приведенные выше результаты противоположны данным, полученным при использовании в реакции полиаденилирования очищенных poly (А) -полимераз. В последнем случае не обнаружена специфичность в выборе затравки, эффективность реакции невелика и размеры добавляемого poly (А)-фрагмента не регулируются (обзор см. [28]).

6. Транскрипция в бесклеточных экстрактах при участии РНК-полимераз I и III

Бесклеточные экстракты содержат значительные количества РНК-полимеразы I (R. Tjian, личное сообщение) и РНК-полимеразы III [19]. Ионные условия, необходимые для функционирования этих двух полимераз, могут отличаться от условий, необходимых для РНК-полимеразы II, и поэтому для определения оптимальных концентраций солей, ДНК и экстракта нужны предварительные исследования. РНК-полимеразы I и III, по-видимому, транскрибируют экзогенные ДНК-матрицы значительно более эффективно, чем это делает РНК-полимераза П. Каждая матрица транскрибируется первыми двумя ферментами за время обычной инкубации 1—10 раз, что в 10—100 раз эффективнее, чем в случае транскрипции РНК-полимеразой II (разд. 4.2). В отличие от РНК-полимераз II и III РНК-полиме-

: Специфическую эндонуклеазную активность, катализирующую in vivo образование З'-концов мРНК для полиаденилирования (обзор см. [15]), in vitro обнаружить не удалось; остатки АМР присоединяются прямо к концу РНК, образующейся при прерванной транскрипции.

Транскрипция генов эукариот в бесклеточных, экстрактах_[09

раза I, по-видимому, обладает видоспецифичностью; РНК-полимераза I, содержащаяся в бесклеточных экстрактах из клеток HeLa, транскрибирует гены рРНК человека, но не транскрибирует гены рРНК мыши .[9].

Поскольку РНК-полимераза III в отличие от РНК-полимеразы II терминирует транскрипцию in vitro и поскольку размеры образующихся при этом РНК обычно относительно невелики (см., однако, ссылку [19]), продукты транскрипции РНК-полимеразой III можно анализировать непосредственно. Следовательно, в данном случае, как правило, нет нужды в прерванной транскрипции и S