l-нуклеазном картировании. Напротив, поскольку на генах рРНК образуются большие транскрипты, для анализа транскрипции РНК-полимеразой I необходимы и прерванная транскрипция, и Sl-нуклеазное картирование.

Наконец, бесклеточные экстракты из целых клеток, по крайней мере приготовленные из клеток HeLa, содержат, по-видимому, большую часть или почти все ферменты, участвующие в процессинге молекул — предшественников тРНК [8], и по крайней мере один из ферментов, необходимых для процессинга молекул — предшественников рРНК [9, 10].

Благодарности

Я благодарен Р. Джоув за предоставление данных эксперимента, приведенного на рис. 1. Работа, выполненная в нашей лаборатории, была субсидирована NIH grant GM-28983.

Литература

1. Roeder R. G. In: RNA Polymerase, Losick R. and Chamberlin M. (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, p. 285, 1976.

2. Weil P. ?., Luse D. S., Segall J., Roeder R. G. Cell, 18, 469 (1979).

3. Grummt I. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 727 (1981).

4. Wu G.-J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 2175 (1978).

5. Manlet/ J. L., Fire ?., Cano ?., Sharp P. ?., Gefter M. L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3855 (1980).

6. Tsujimoto Y., Hirose S., Tsuda M., Suzuki Y. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4838 (1981).

7. Wasulyk В., Kedinger C., Garden I., Brison O., Chambon P. Nature, 285, 366 (1980).

8. Standring D. K., Venegas ?., Rutter W. G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 5963 (1981).

9. Grummt I., Roth E., Pauie M. R. Nature, 296, 173 (1982).

10. Miller K. G., Sollner-Webb B. Cell, 27, 165 (1981).

11. Manley J. L. Cell, 33, 595 (1983).

12. Weingartner В., Keller W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4092 (1981). 13 Goldenberg C. J., Raskas H. J. Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 78, 5430 (1981).

14. Kole R., Weissman S. M. Nucleic Acids Res., 10, 5429 (1982).

15. Manley J. L. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 30, (1983). in press.

16. Sugden В., Keller W. J. Biol. Chem., 248, 3777 (1973).

17. McMaster G. K., Carmichael G. C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4835 (1977).

18 Lewis ?. K., Burgess R. R. J. Biol. Chem., 255, 4928 (1980). 19. Manley J. L., Colozzo ?. T. Nature, 300, 376 (1982).

20 Zimmerman S. В., Sandeen G. Anal. Biochem., 14, 269 (1966).

21 Berk A. J., Sharp P. A. Cell, 12, 721 (1977).

22 Hansen U., Tenen D. J., Livingston D. M., Sharp P. A. Cell, 27, 603 (1981). 23! Fire ?., Baker С. C., Manley J. L, Ziff E. В., Sharp P. A. J. Virol., 40, 703

24 Handa' H., Kaufman R. J., Manley J. L., Gefter M. L., Sharp P. A. J. Biol.

Chem., 256, 478 (1981). 25. Jove R., Manley J. L. J. Biol. Chem., 259, 8513 (1984).

26 Jove R. Manley J. L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 5842 (1982).

27 Manley J. L, Sharp P. ?., Gefter M. L. J. Mol. Biol., 135, 171 (1979).

28 Edmonds M., Winters M. A. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 17, 149 (1976).

ГЛАВА 4

ТРАНСКРИПЦИЯ РНК В ИЗОЛИРОВАННЫХ ЯДРАХ

У. Марзлаф и Р. Хуан

1. Введение

Прежде чем исследовать механизм транскрипции специфических генов и процессинга первичных транскриптов в эукариотических клетках необходимо иметь адекватные системы транскрипции in vitro. Для их создания было использовано два основных подхода. При первом подходе в систему добавляют изолированные ядра, т. е. матрицей для транскрипции служит эндогенный хроматин. При втором подходе матрицами служат специфические клонированные фрагменты ДНК. В первом случае основной упор делают на сохранении in vitro клеточных активностей, а во втором усилия концентрируют вокруг определения последовательностей ДНК и белковых факторов, необходимых для точной экспрессии клонированных генов в данной пробе. Оба подхода имеют свои преимущества, и для понимания разных аспектов биосинтеза РНК их нужно рассматривать совместно. Второй подход обсуждается в гл. 3, а здесь мы остановимся на первом подходе.

Принципиальное преимущество использования изолированных ядер при исследовании транскрипции состоит в том, что эта система максимально приближается к интактной клетке. В изолированном ядре хроматин сохраняет свое нативное состояние, целостность ядра поддерживается во время бесклеточного синтеза РНК и новообразованная РНК остается связанной с ядром, как и в интактной клетке. Таким образом, в первом приближении активность, измеряемая нами, отражает активность того же ядра в клетке. По-видимому, в изолированном ядре экспрессируются те же самые гены с теми же относительными активностями, что и в интактной клетке.

Однако использование изолированных ядер имеет свои недостатки, которые перечислены ниже.

1. Сложность синтезируемых РНК. Вероятно, в изолированных ядрах транскрибируются все ??4—105 генов, функционирующих в интактной клетке. Следовательно, для изучения синтеза какой-то определенной РНК необходимы особо чувствительные методики (гибридизация).

2. В изолированных ядрах присутствует много РНК-полимераз, уже вовлеченных в транскрипцию РНК, и, следовательно,

112

Глава 4

начальная РНК-синтезирующая активность, наблюдаемая in vitro, в основном отражает завершение синтеза соответствующих цепей РНК. Поэтому, чтобы различить молекулы, инициированные in vitro, и молекулы, которые были просто достроены, необходимы чувствительные методы анализа инициации синтеза РНК-

3. Изолированные ядра содержат большое количество эндогенной РНК- Если ее не отделить от РНК, синтезированной in vitro, то она будет искажать результаты гибридизации, которую проводят с целью выявить количество новосинтезированной РНК.

Для решения проблем, связанных с перечисленными выше недостатками, в наших лабораториях было разработано несколько полезных методов. Найдены способы измерения относительных скоростей транскрипции и их изменения. Разработаны чувствительные методы измерения инициации цепи с использованием в качестве субстратов тионуклеозидтрифосфатов, а в качестве гибридизационных зондов — соответствующих клонированных последовательностей ДНК Наконец, поскольку предполагают, что РНК после транскрипции организуется в виде рибонуклеопротеиновых частиц, последние можно использовать при изучении процессинга и транспорта РНК- Мы работали только с клетками культуры миеломы мыши и зародышами морского ежа, но большинство этих методов широко применяется во многих эукариотических системах.

2. Выделение ядер

2.1. Введение

Задача состоит в получении бесклеточной системы, активной в отношении синтеза РНК Синтезированная РНК и качественно, и количественно должна быть адекватна РНК, синтезируемой в интактных клетках. В частности, должна транскрибироваться нужная цепь ДНК, а инициация, терминация и процессинг должны происходить in vitro в тех же самых сайтах, что и in vivo. Кроме того, in vitro должны экспрессироваться только те гены, которые экспрессируются in vivo. Чтобы получить ядра, адекватно синтезирующие РНК, необходимо, чтобы во время выделения сохранялись РНК-полимеразная активность и структура ядра, но удалялись разрушающие активности (нуклеазы, протеазы, трифосфатазы). Не столь существенно, неочи-щенны или высокоочищенны ядра, главное, чтобы в них шел адекватный синтез РНК.

Выбор исходного материала для выделения, очевидно, зависит от конкретных целей последующих экспериментов. По воз-

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

113

можности лучше всего начинать работу с культивируемыми клетками [1, 2], в частности потому, что большинство клеток млекопитающих в культуре содержит незначительные количества эндогенных нуклеаз и протеаз. Однако если изучают ген, который экспрессируется только в данной ткани, или если его функционирование регулируется определенным образом в ткани интактного животного, то, очевидно, нужно начинать с самой этой ткани. Вместе с тем при работе с тканями возникают многочисленные проблемы, в том числе проблема клеточной гетерогенности. Тем не менее при тщательной постановке эксперимента можно выделить ядра с высокой РНК-синтезирую-щей активностью из целого ряда тканей [3, 4]. В данном разделе описываются основной метод и его модификации, применимые к клеткам самых различных типов.

2.2. Основной метод

2.2.1. Клетки культуры ткани

Ядра, обладающие высокой активностью в отношении синтеза РНК, легко выделить из клеток HeLa простым лизисом клеток в Nonidet Р-40 (NP-40) с последующим осаждением ядер центрифугированием при низкой скорости [5]. Однако клетки HeLa являются исключением. Показано, что для клеток всех других изученных культур наиболее подходящий способ выделения активных ядер — это лизис клеток в изоосмотическом растворе с последующей очисткой ядер путем центрифугирования через плотный раствор сахарозы [1, 2]. Неионный детергент легко вызывает лизис клеток без их предварительного набухания и значительно уменьшает количество цитоплазматических примесей. Основной метод выделения ядер описан в табл. 1. Поскольку плотность ядер зависит от типа клеток,из которых их выделяют, в предварительных опытах следует определить нужную концентрацию сахарозы в буфере II (табл. 1); на основе буфера II готовят сахарозную «подушку», через которую осаждаются ядра (табл. 1, пп. 4 и 5). Например, ядра клеток миеломы не будут седиментировать через сахарозу с концентрацией выше 2,05 М, а ядра ранних зародышей морского ежа не будут седиментировать при концентрациях сахарозы выше 1,95 М. Концентрация сахарозы, при которой ядра седиментируют, лежит в пределах от 1,8 до 2,2 М. Важна также концентрация сахарозы в гомогенате, который наслаивается на сахарозную «подушку» (табл. 1, п. 4). Она должна быть достаточно высокой, чтобы препятствовать накоплению внутриклеточных мембран и органелл в интерфазе, в противном случае выход ядер существенно снижается. Конечная концентра-8-953

114

Глава 4

Таблица 1. Выделение ядер из клеток культур ткани1

1. Приготовьте следующие три буфера, не добавляя к ним ДТТ и тритон Х-100. Проавтоклавируйте их и храните при 4°С. Перед использованием добавьте ДТТ и тритон Х-100 из концентрированных растворов (1 ? ДТТ, 10%-ный тритон Х-100).

Буфер I

0,32 ? сахароза

3,0 мМ СаС12

2,0 мМ ацетат магния

0,1 мМ ЭДТА<