p>0,1%-ный тритон Х-100

1,0 мМ ДТТ

10,0 мМ трис-HCl, рН 8,0 Буфер II

2,0 ? сахароза

5,0 мМ ацетат магния

0,1 мМ ЭДТА

1,0 мМ ДТТ

10,0 мМ трис-HCl, рН 8,0 Буфер для хранения 25%-ный глицерол 5,0 мМ ацетат магния 0,1 мМ ЭДТА 5,0 мМ ДТТ

50,0 мМ трис-HCl, рН 8,0

2. Отцентрифугируйте клетки (500 g 5 мин при 25 С) и ресуспендируйте их в буфере I до плотности 5-Ю6—2-107 клеток/мл2.

3. Гомогенизируйте клетки (10—15 движениями) в гомогенизаторе Даунса с плотно пригнанным пестиком типа «В».

4. Разбавьте гомогенат одним-двумя объемами буфера II и наслоите его поверх «подушки» из буфера II, занимающей одну треть объема центрифужной пробирки.

5. Отцентрифугируйте при 30 000 g 45 мин при 4 С3.

6. Ресуспендируйте ядра до концентрации 5· 107—2· 108/мл (0,5—2,0 мг ДНК/мл) в буфере для хранения. Ядра, выделенные из клеток с более низким содержанием ДНК на ядро, хранят при такой же концентрации ДНК.

7. Быстро заморозьте ядра маленькими порциями и храните их в жидком азоте.

1 При получении ядер из клеток, в которых эндогенные нуклеазы или протеазы могут осложнить выделение, во все буферы следует добавлять ингибиторы, как указано в разд. 2.3.

2 Перед ресуспендированием в буфере I клетки можно промыть солевым раствором, забуференным фосфатным буфером, но мы считаем, что для клеток из культуры ткани это не обязательно.

3 Предварительное отделение ядер от гомогената центрифугированием при низкой скорости не дает удовлетворительных результатов. Вместе с ядрами осаждается много постороннего материала, который потом очень трудно отделить от ядер.

ция сахарозы в гомогенате регулируется объемом добавляемого к нему буфера II (табл. 1, п. 4), и ее следует определить в предварительном эксперименте. Например, при получении ядер из зародышей морского ежа нужно повысить концентрацию сахарозы в гомогенате перед центрифугированием до 1,4 М, иначе интерфаза становится комковатой и вязкой из-за скапли-

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

115

вающегося в ней мембранного материала [6]. Наконец, очень, важно использовать разведенные гомогенаты, так как при этом можно уменьшить и количество материала в интерфазе, и количество побочных примесей, адсорбированных на ядрах. Ядра, замороженные в жидком азоте, сохраняют свою активность в течение нескольких месяцев, но после оттаивания их не следует замораживать вторично.

Мы показали, что данный метод очень хорош при работе с несколькими линиями культивируемых клеток и зародышами морского ежа. Другие исследователи применили аналогичные методы на клетках других типов.

2.2.2. Целые ткани

Основной метод приведенный выше для выделения ядер из-культивируемых клеток, можно применять также для выделения ядер из целых тканей после их гомогенизации. Удобная методика описана в табл. 2.

Таблица 2. Выделение ядер из целых тканей

1. Приготовьте буферы согласно табл. 1, п. 1, и добавьте в них ингибиторы, перечисленные в разд. 2.3.

2. Разрежьте ткань на мелкие кусочки1. Промойте их в охлажденном во льду 0,14 ? NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0.

3. Гомогенизируйте кусочки ткани в буфере I2, используя подходящей гомогенизатор3 (10 мл буфера I на 1 г ткани).

4. Быстро профильтруйте гомогенат через несколько слоев марли, чтобы удалить соединительную ткань.

5. Гомогенизируйте фильтрат (10—20 движениями пестика типа «В» в гомогенизаторе Даунса). Контролируйте лизис клеток с помощью микроскопа.

6. Проведите выделение ядер согласно табл. 1, пп. 4—7.

1 При выделении ядер из печени перед этой стадией промойте печень раствором 0.14 ? NaCl, 10 мМ трнс-HCl, рН 8,0. ? ?

2 Состав буфера I приведен в табл. 1.

3 Выбор гомогенизатора зависит от типа ткани. Для мягких тканей таких как печень, подходит гомогенизатор Даунса.

2.3. Меры защиты от нуклеаз и протеаз

При работе с клетками, в которых эндогенные протеазы представляют потенциальную опасность, во все буферы, используемые для выделения ядер, и в буфер для хранения следует добавлять PMSF (табл. 1) до конечной концентрации 0,1 мМ (концентрация исходного раствора PMSF в изопропа-ноле 0,1 М). Он эффективно ингибирует сериновые протеазы, не влияя на синтез РНК. Исключить эндогенную нуклеазную активность гораздо труднее. Нуклеазы, для функционирования которых необходимы дивалентные ионы, в том числе многие

8*

116

Глава 4

Таблица 3. Проверка Д ? Казной, РНКазной и протеазной активности изолированных ядер

ДНКаза

Чтобы исследовать ДНКазную активность изолированных ядер, можно проверить, как деградирует либо эндогенная, либо экзогенная ДНК1. Второй вариант больше подходит для выявления небольших количеств ДНКазы. Эндогенная ДНК

1. Проинкубируйте ядра в условиях, идентичных условиям реакции транскрипции (табл. 5), 30 мин, не внося радиоактивные нуклеозидтрифосфаты.

2. Лизируйте ядра добавлением десяти объемов 1%-ного ДСН, 0,5 ? NaCl, 10 мМ ЭДТА, рН 8,0. Добавьте протеиназу К до концентрации 50 мкг/мл и проинкубируйте при 37 °С 30 мин.

3. Добавьте равный объем фенола, насыщенного 50 мМ трис-HCl, рН 8,5. Энергично перемешайте и разделите фазы центрифугированием при низкой скорости.

4. Отберите водную фазу и диализуйте ее против 10 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0.

5. Определите размеры выделенной эндогенной ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле, сравнивая ее с ДНК, выделенной из ядер, не инкубированных в условиях транскрипции. Используйте 0,8%-ный агарозный гель и буфер для электрофореза: 1 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-борат, рН 8,3. В пробы с ДНК добавьте бромфеноловый синий до конечной концентрации 0,001% и нанесите их на гель. На отдельную дорожку нанесите в качестве маркеров молекулярной массы ДНК фага ?, обработанную рестрикта-зой Hind III, вместе с интактной ДНК фага ?. Проводите электрофорез при 100 В до тех пор, пока бромфеноловый синий не дойдет до края геля. Окрасьте гель бромистым этидием 0,5 мкг/мл 15 мин, чтобы сделать ДНК видимой. Выявите полосы ДНК при УФ-освещении. После инкубации в течение 30 мин ДНК из ядер клеток миеломы мыши, например, должна быть больше 50 kb, а ДНК из ядер морского ежа — больше 20 kb.

Экзогенная ДНК

1. Проинкубируйте ядра в условиях, идентичных условиям реакции транскрипции (табл. 5), 30 мин, добавив сверхспиральную плазмидную ДНК (2 мкг на 0,2 мл реакционной смеси), но не внося радиоактивных нуклео-зидтрифосфатов.

2. Выделите ДНК и определите ее размеры с помощью электрофореза в агарозном геле, как описано выше. Исчезновение сверхспиральной ДНК и появление открытой кольцевой ДНК свидетельствуют об одноцепочечных разрывах, что может быть результатом топоизомеразной активности.

РНКаза

1. Проинкубируйте ядра, как описано в табл. 5.

2. Через 5 мин выделите РНК из части реакционной смеси, пользуясь методикой, приведенной в табл. 6.

3. Добавьте 40-кратный избыток (2 мМ) немеченого рибонуклеозидтрифос-фата. При этом прекращается включение метки в РНК, но синтез РНК не подавляется. Инкубируйте еще 25 мин и затем выделите РНК из реакционной смеси, как описано в табл. 6.

.4. Определите размеры меченой РНК в двух пробах (п. 2 и п. 3, приведенные выше) либо путем центрифугирования в сахарозном градиенте (табл. 7), либо путем электрофореза в агарозном геле (табл. 8). Выявите меченую РНК с помощью сцинтилляционного счетчика или радиоавтографии. Если ядра не содержат значительной РНКазной активности, то РНК в обеих пробах будет высокомолекулярной и будет иметь приблизительно одинаковые размеры. Если требуется, гели можно окрасить бромистым этидием (таол 8), чтобы определить размеры эндогенной РНК.

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

117

Протеаза

1. Проинкубируйте 30 мин ядра, как описано в табл. 5, исключив из реакционной смеси радиоактивный рибонуклеозидтрифосфат.

2. Добавьте равный объем 0,4 ? H2S04 и проинкубируйте при 4 °С 30 мин.

3. Отцентрифугируйте при 10 000 g 10 мин. Соберите супернатант и добавьте четыре объема этанола. Перемешайте и оставьте смесь при —20 °С на ночь или при —70 °С на 2 ч.

4. Осадите выпавшие в осадок гистоны центрифугированием при 10 000 g 10 мин.

5. Промойте осадок гистонов 80%-ным этанолом и затем высушите под вакуумом.

6. Проанализируйте гистоны с помощью электрофореза в геле. Три применяемые методики описаны в литературе [7—9]. Протеазную активность изолированных ядер выявляют по деградации гистонов в инкубированных ядрах по сравнению с гистонами, выделенными из ядер, не подвергавшихся инкубации. Особенно чувствителен к деградации под действием протеазы гистон HI.

!%-ногБоЫСДТсН. ?0РТ«т"е^Д^К8а^н?а^ V™3""* ЯДеР ДеСЯ™° объемами гель: если же размеры ДНК уменьшись СТ' лнзированные ядра образуют «ее), то раствор' выглядит отиосител^но невязк*м. " незнаЧ1"^ьно (до 20 kb или ме-

ДНКазы [6, 10], ингибируются при удалении всех дивалентных катионов из буфера I (табл. 1) и добавлении ЭГТА до 1 мМ и спермидина до 1 мМ.

Поскольку для точной транскрипции нужна интактная структура хроматина, несмотря на принятие таких защитных мер, важно исследовать ядра на интактность и ДНК, и гистонов. Удобные тесты описаны в табл. 3. Кроме того, ядра можно проверить на присутствие РНКазы с помощью «чейз»-эксперимен-та (разведения метки; табл. 3). Ядра инкубируют в стандартных условиях транскрипции, но через 5 мин добавляют избыток немеченых рибонуклеотидов (2 мМ) и продолжают инкубацию. Если размеры РНК-продукта, оцениваемые путем центрифугирования в сахарозном градиенте или электрофореза в геле, не изменяются и остаются достаточно большими, то РНКазной активности в этих ядрах практически нет.

2.4. Варианты метода выделения ядер

2.4.1. Клетки, богатые пигментными гранулами или лизосомами

В тех случаях, когда в ткани или в культивируемых клетках имеется большое количество гранул пигмента или лизосом, использование стандартного метода (разд. 2.2) с применением неионного детергента приводит к лизису этих органелл, адсорбции вышедших пигментов на ядрах и, возможно, деградации определенных компонентов ядра вышедшими лизосомными ферментами. Чтобы избежать таких последствий, ядра из клеток этого

118

Глава 4

типа выделяют