по аналогичной методике, но без использования детергента. Клеткам дают набухнуть в 25 мМ КС1, 2 мМ ацетате магния, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мин при 4°С и затем гомогенизируют их как обычно (табл. 1 и 2). Гранулы пигмента и лизосомы остаются интактными, и их отделяют от ядер при последующем центрифугировании.

2.4.2. Неводные методы выделения ядер

При использовании водных методов выделения большое количество материала из ядер теряется, в том числе все малые молекулы, многие ферменты и, возможно, часть РНК- Гарни [11] впервые применил неводные методы, с помощью которых получил ядра, содержащие все малые молекулы, в норме присутствующие в ядрах in vivo. Эти ядра активны в отношении синтеза и РНК, и ДНК-

2.5. Выделение хроматина с эндогенной РНК-полимеразной активностью

Из изолированных ядер можно выделить хроматин, в котором сохраняется эндогенная РНК-полимеразная активность [12] (табл. 4). Хроматин, выделенный этим способом, по активности в синтезе РНК почти не уступает интактным ядрам. Однако он теряет активность при замораживании, в то время как ядра можно хранить в жидком азоте несколько месяцев. Методы выделения хроматина и транскрипция экзогенными РНК-полимеразами подробно описаны в гл. 5.

Таблица 4. Выделение транскрипционно активного хроматина1

1. Выделите ядра, как описано в табл. 1 или 2.

2. Ресуспендируйте ядра в 10%-ном глицероле, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-НС], рН 8,0, до концентрации 5-107 ядер/мл. Отцентрифугируйте суспензию при 1000 g 2 мин.

3. Повторяйте стадию 2 до тех пор, пока ядра не лизируются, давая желеобразный осадок (хроматин).

4. Ресуспендируйте хроматин в 1 мл раствора: 0,12 ? КС1, 10%-ный глице-рол, 1 мМ ДТТ, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, и отцентрифугируйте суспензию при 1000 g 2 мин2.

5. Ресуспендируйте хроматин при концентрации ДНК 1 мг/мл (108 ядер на 1 мл культивируемых клеток мыши) в 10%-ном глицероле, 1 мМ ДТТ, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, набирая и выпуская суспензию шприцем сначала через иглу для иъекций № 18, а затем № 22.

6. Используйте хроматин для транскрипции сразу после выделения, инкубируя его в условиях синтеза РНК в изолированных ядрах (табл. 5).

1 См. также табл. 1, гл. 5.

2 Эта стадия отмывки, предназначенная для удаления нехроматиновых компонентов, ие обязательна. В 0,12 ? КС1 нехроматииовые компоненты растворимы, тогда как хроматин нерастворим.

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

119

3. Синтез РНК в изолированных ядрах

3.1. Условия синтеза РНК

Для проведения синтеза РНК ядра инкубируют в присутствии всех четырех рибонуклеозидтрифосфатов, один из которых является радиоактивно меченным. Максимальная скорость транскрипции наблюдается при концентрациях СТР, GTP и UTP по крайней мере 50 мкМ и АТР 100 мкМ. Обычно концентрация в пробах каждого из трех немеченых трифосфатов составляет 500 мкМ, а меченого трифосфата — 50 мкМ (если радиоактивным трифосфатом является АТР, то его концентрация равна 100 мкМ).

В исследованиях in vitro с использованием ДНК-матриц показано, что РНК полимеразы, I, II и III имеют разные опти-мумы концентраций солей. Однако, очевидно, в клетке все эти ферменты функционируют в одинаковых условиях, и поэтому был найден один оптимум для синтеза РНК в ядрах млекопитающих для всех трех полимераз: 80— 120 мМ КС1, 5—8 мМ ацетат магния, 25 мМ трис-HCl, рН 7,5—8,0. Если условия изменяются в указанных пределах, то значительного изменения в активности синтеза не наблюдается. При низких концентрациях соли (<25 мМ КС1) активности РНК-полимераз II и III уменьшаются, и в этом случае функционирует в основном РНК-полимераза I. In vitro в присутствии ДНК-матрицы ионы Мп2+ сильно стимулируют РНК-полимеразу II, но в изолированных ядрах даже низкие концентрации ионов ,Mn2+ (1 мМ) ингибируют транскрипцию всеми тремя полимеразами приблизительно на 50%. Добавление полиаминов спермина или спермидина в конечной концентрации 1 мМ не влияет на уровень синтеза суммарной РНК. Подробно метод транскрипции в изолированных ядрах описан в табл. 5. Реакционная смесь состоит из двукратно сконцентрированного раствора различных солей и рибонуклеозидтрифосфатов и равного объема ядер. В качестве радиоактивного предшественника можно использовать любой из четырех [а-32Р]-нуклеозидтрифосфатов. Однако, как было показано в наших опытах, в некоторых ядрах, например в ядрах морского ежа, при использовании [ct-32P]-UTP метка включается в З'-конец некоторых РНК. Известны также реакции, в которых [<х-32Р]-АТР (полиаденилирование или созревание тРНК) или [а-32Р]-СТР (созревание тРНК) присоединяются к концам интактных РНК. Кроме того, [a-P32]-GTP является субстратом в реакции кэпирования. Поэтому, несмотря на то, что скорости включения различных меченых трифосфатов близки, в большинстве экспериментов лучше всего использовать [a-32P]-GTP, так как этот нуклеотид меньше других

120

Глава 4

Таблица 5. Транскрипция в изолированных ядрах

1. Приготовьте следующие три раствора, используя проавтоклавированную дистиллированную воду, и храните их при —20 °С.

Раствор А

2 мМ каждого из нуклеозидтрифосфатов: АТР, СТР, UTP

0,2 мМ [ct-32P]-GTP (10—40 Ки/ммоль; 500—1000 мкКи/мл)1

0,1 мМ S-аденозилметионин Чтобы приготовить этот раствор, добавьте по одной десятой конечного объема отдельных концентрированных растворов (20 мМ каждый) АТР, СТР, UTP к одной десятой объема 1 мМ S-аденозилметиошша в 1 мМ H2S04. Лиофилизуйте [a-32P]-GTP и вновь растворите его в растворе А, содержащем GTP, так чтобы конечная общая концентрация меченого и немеченого GTP составляла 0,1—0,2 мМ. Важно, чтобы рН раствора был 7,0. Поэтому если-используемые нуклеотиды находятся в форме свободных кислот, то доведите рН до 7,0 трисом. Для получения нужного конечного объема добавьте воды. Раствор Б

0,6 ? КС1

12,5 мМ ацетат магния Раствор В

1%-ный ДСН

10 мМ ЭДТА, рН 7,0

2. В расчете на реакционную смесь с конечным объемом 0,2 мл смешайте 50 мкл раствора А, 40 мкл раствора Б и 10 мкл проавтоклавированной дистиллированной воды. Чтобы началась реакция, добавьте 0,1 мл суспензии ядер в буфере для хранения (табл. I)2. Инкубацию проводите при 25 °С.

3. Чтобы следить за ходом транскрипции, отбирайте пробы (1—5 мкл) в начале инкубации и через 10-минутные интервалы, нанося их на диски фильтровальной бумаги Whatman I ММ, помеченные карандашом. Диски положите в ванночку с охлажденной во льду 10%-ной ТХУ и 1%-ным пирофос-фатом натрия (15—30 мл на фильтр). Инкубируйте их во льду 10 мин, изредка помешивая. Слейте раствор и сполосните фильтры два раза по 5 мин 5%-ной ТХУ, 1%-ным пирофосфатом натрия. Наконец, ополосните фильтры в абсолютном этаноле или ацетоне, высушите их на воздухе и определите радиоактивность на фильтрах в сцинтилляционном счетчике, используя сцинтиллятор на основе толуола.

В типичном случае количество радиоактивности, включенной в ТХУ-нерастворимый материал, будет увеличиваться в течение начального 30-минутного периода инкубации в 20—100 раз. В начале инкубации наблюдается значительный фон радиоактивности, возникающий в результате неспецифического связывания меченого нуклеотида с ядрами.

4. Остановите реакцию добавлением десяти объемов раствора В и хорошо перемешайте. Это приводит к лизису ядер и образованию прозрачного вязкого раствора.

5. Проэкстрагируйте РНК по методу, описанному в табл. 6.

1 Раствор А, состав которого приведен здесь, содержит в качестве меченого рибо-нуклеозидтрифосфата [а-32Р1-GTP. Можно использовать любой другой радиоактивный нуклеотид (см. текст). Во всех случаях конечная концентрация меченого нуклеотида в реакционной смеси должна быть 0,05—0,1 мМ.

2 Буфер трис-HCl вносят в реакционную смесь (разд. 3.1) с буфером для хранения, в котором суспендированы ядра.

включается в РНК в реакциях, не связанных с транскрипцией. Реакционную смесь инкубируют при 25—37 °С в случае ядер клеток млекопитающих и при 15—25 °С в случае ядер из клеток мор

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

121

ского ежа. Обычно предпочитают температуру 25 °С, при которой синтез РНК идет гораздо дольше. По-видимому, нет значительных различий между типами РНК, синтезируемыми при разных температурах в указанных пределах, хотя систематического исследования в этом плане не лроводилось. Реакционную смесь инкубируют 30—60 мин и затем выделяют суммарную РНК (разд. 3.3) для последующего анализа.

Если потребуется, можно определить зависимость траскрип-ции от времени путем отбора проб через различные интервалы времени и определения ТХУ-нерастворимой радиоактивности (табл. 5). Количество синтезированной РНК выражают в пико-молях GMP, включившегося в 1 мкг ДНК за единицу времени. Концентрацию ДНК определяют путем подсчета числа ядер в определенном разведении с помощью гемоцитометра (если известно содержание ДНК в одном ядре) или стандартным колориметрическим методом определения ДНК. Как правило, начальная скорость синтеза РНК составляет 0,1—0,2 пмоль включившегося GMP/мкг ДНК/мин. Синтез РНК обычно продолжается по крайней мере 1 ч, хотя часто с несколько сниженной скоростью — 0,05—0,1 пмоль включившегося GMP на 1 мкг ДНК в 1 мин.

3.2. Определение активности различных РНК-полимераз

Активность трех эукариотических РНК-полимераз можно четко различить с помощью циклического пептида грибов ?-аманитина (рис. 1). В концентрации 0,01 мкг/мл он ингибирует активность РНК-полимеразы II млекопитающих на 50%, в то время как РНК-полимераза III ингибируется в такой же степени только при гораздо более высоких концентрациях ?-аманитина (25 мкг/мл) [13]. Вместе с тем РНК-полимераза I вообще не ингибируется этим пептидом. Поэтому, чтобы определить долю синтеза РНК, осуществляемого каждой из полимераз, нужно провести три отдельные инкубации (табл. 5): а) без ?-аманитина, б) с 0,5 мкг/мл ?-аманитина и в) со 100 мкг/мл ?-аманитина.

Добавьте ?-аманитин в соответствующие реакционные смеси перед добавлением ядер. Затем добавьте ядра и оставьте смеси во льду на 5 мин. Чтобы началась реакция, перенесите смеси на 25 °С.

Разница в количествах РНК, синтезированной в реакциях а) и б), отражает активность РНК-полимеразы II.