Разница этих величин между б) и в) отражает активность РНК-полимеразы III, а активность в реакции в) —это активность РНК-полимеразы I. В ядрах, выделенных из клеток, растущих в культуре, 45% синтеза РНК обеспечивается РНК-полимеразой I,

122

Глава 4

Рис. 1. Синтез РНК в изолированных ядрах морского ежа в присутствии различных концентраций ?-аманитина. После выделения из внеядерной фракции РНК была проанализирована методом электрофореза в полиакриламидном геле, как описано в табл. 8. Гель окрашивали бромистым этидием для локализации РНК-маркеров 5,8S, 5S и 4S и затем методом радиоавтографии выявляли радиоактивные РНК-транскрипты. Использовали следующие концентрации ?-аманитина: дорожка 1 — ?-аманитин отсутствует; дорожка 2—1 мкг/мл; дорожка 3—10 мкг/мл; дорожка 4—100 мкг/мл; дорожка 5 — 250 мкг/мл; дорожка 6 — 500 мкг/мл. На дорожку 7 нанесены 4S-tPHK и 5S-pPHK. N1-РНК-транскрипт является продуктом РНК-полимеразы II, а все остальные РНК — продуктами РНК-полимеразы III. РНК, мигрирующие между 4S и 5S рРНК, являются предшественниками тРНК. N1 и N3 — малые ядерные РНК [6]. СЗ — главная малая цитоплазматическая РНК- А, В, С — неидентифицированные РНК, которые in vivo не обнаруживались.

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

123

50% — РНК-полимеразой II и 5% — РНК-полимеразой III. В ядрах зародыша (бластулы) морского ежа 90—95% активности обеспечивается РНК-полимеразой II, а остальная часть— РНК-полимеразами I и III. В каждом случае доля суммарной активности, приходящейся на каждую полимеразу, сходна с ее долей in vivo, и это указывает на то, что в условиях, описанных выше, изолированные ядра отражают картину синтеза РНК in vivo.

3.3. Выделение РНК

После завершения реакции РНК можно выделить любым из стандартных методов, применяемых для ядерной РНК: &) экстракцией фенолом в присутствии ДСН при рН5,0 и 55 °С [14]; б) обработкой ДНКазой I с последующей экстракцией •фенолом [15]; в) экстракцией в присутствии гуанидинийизотио-цианата [16].

Метод с гуанидинийизотиоцианатом был разработан для ядер тканей, в которых содержится много эндогенных РНКаз. Обычно его не применяют, так как если транскрипция идет хорошо, то это означает, что ядра не содержат значительных количеств РНКазы (разд. 2.3). При обработке ДНКазой I в препарате РНК остаются небольшие фрагменты ДНК [15]. Поэтому из этих трех методов мы предпочитаем метод с горячим фенолом и ДСН, который описан в табл. 6.

Таблица 6. Выделение РНК

1. После остановки реакции транскрипции добавлением десяти объемов раствора В (табл. 5, п. 4) добавьте '/?? объема 2 ? ацетата натрия, рН 5,0 и хорошо перемешайте.

2. Добавьте равный объем смеси насыщенного водой фенола и хлороформа (2:1) и хорошо перемешайте.

3. Проинкубируйте смесь при 55 °С 5 мин и затем охладите во льду в течение 5 мин.

4. Отцентрифугируйте смесь при 10 000 g 10 мин при 4 °С.

5. Осторожно отберите водную (верхнюю) фазу, стараясь не захватить интерфазу.

¦6. Добавьте к водной фазе 2,5 объема абсолютного этанола и оставьте при —70 °С на 1 ч (или при — 20 °С на 16 ч), чтобы РНК выпала в осадок.

7. Осадите РНК центрифугированием при 10 000 g 10 мин при 4 "С.

8. Промойте РНК, ресуспендируя осадок в холодном (4 °С) 70%-ном этаноле с последующим центрифугированием согласно п. 7.

9. Повторите п. 8.

10. Высушите осадок РНК под вакуумом и растворите его в 0,5 мл 0,3 ? NaCl, 0,1%-ного ДСН, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5.

11. Удалите невключившийся меченый нуклеотид путем хроматографии на колонке (0,5X10 см) с сефадексом G50 или биогелем Р6 в указанном выше буфере.

12. Осадите РНК из свободного объема этанолом, как описано в пп. 6 и 7.

13. Растворите РНК в стерильной воде и храните при —20 °С.

124

Глава 4

4. Общий анализ синтеза РНК

Метод, используемый для анализа транскрипции в изолированных ядрах, зависит от целей эксперимента. В разд. 4.1, 4.2 и 4.3 описаны основные приемы анализа суммарных РНК-продуктов, определение скорости элонгации цепей РНК в ядрах и исследование инициации транскрипции соответственно. Описание методов анализа РНК-транскриптов отдельных генов приведено в разд. 5.

4.1. Анализ суммарных РНК-продуктов ' ;

Размеры суммарных РНК-продуктов можно определить двумя способами: путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (табл. 7 и рис. 2), регистрируя присутствие транскриптов во фракциях по радиоактивности, или с помощью электрофореза небольших РНК-транскриптов в денатурирующих полиакриламидных гелях (табл. 8 и рис. 1), а больших РНК-транскриптов — в денатурирующих агарозных гелях (табл. 8). Если в ядрах нет рибонуклеазы, то размеры РНК-продукта относительно велики ('[1] и рис. 2).

Таблица 7. Центрифугирование РНК в сахарозном градиенте

1. Приготовьте сахарозные градиенты 10—40% (вес/объем) в 0,1 ? NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1%-ном ДСН, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5. В этих пределах концентраций сахарозы можно разделить все РНК, представляющие интерес (4—45S).

2. Растворите РНК в 0,1%-ном ДСН, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5. Наслоите 0,5 мл раствора РНК на 17 мл градиента или 1,5 мл раствора РНК на 38 мл градиента.

3. Отцентрифугируйте градиенты при 90 000 g 16 ч в роторе Sorvall АН627 или Beckman SW27. При данных условиях 28S-PHK седиментирует на расстояние до 60% длины центрифужной пробирки.

4. Разделите каждый градиент на 25 фракций, пропуская его через УФ-детек-тор, установленный на 254 нм. В изолированных ядрах имеется достаточное количество рРНК (28S и 18S), которая может служить маркером при регистрации УФ-поглощения таким способом. Определите положение меченых РНК-транскриптов, нанеся пробу (5—20 мкл) из каждой фракции на диск фильтровальной бумаги Whatman и определив ТХУ-нерастворимую радиоактивность способом, описанным в табл. 5, п. 3.

Небольшие РНК, в том числе 5S-pPHK и тРНК, можно четко обнаружить и количественно определить с помощью электрофореза в геле, а индивидуальные мРНК необходимо выявлять с помощью чувствительных гибридизационных тестов, описанных в разд. 5.

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

125

Таблица 8. Электрофорез РНК в геле

Малые РНК-транскрипты

Малые РНК (<8S) легко анализировать методом электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии 7 ? мочевины.

1. Приготовьте концентрированный раствор акриламида: бисакриламида (30:1) следующим образом:

Акриламид 30 г

Бисакриламид 1 г

Мочевина 42 г

20Х ТБЭ-буфер1 5 мл

Дистиллированная вода до конечного объема 100 мл

2. Дегазируйте нужный для данного электрофорезного аппарата объем концентрированного раствора акриламид : бисакриламид с помощью вакуумного насоса в течение 10 мин. Добавьте 30 мкл TEMED и 0,7 мл свежеприготовленного 10%-ного персульфата аммония на 100 мл гелевой смесиу хорошо перемешайте и залейте гель.

3. Растворите радиоактивную РНК в небольшом объеме дистиллированной воды. Смешайте 10 мкл РНК с 20 мкл 10 ? мочевины, 0ДХТБЭ1, 0,001 %-ного бромфенолового синего, 0,001 %-ного ксиленцианола. Прогрейте-при 65 °С 10 мин и затем нанесите пробу на гель.

4. Проводите электрофорез при 900—1000 В, используя в качестве электродного буфера 1ХТБЭ1, пока ксиленцианол не достигнет нижнего края геля2. Во время электрофореза пластинки геля должны быть горячими на ощупь.

5. Перенесите гель на фильтровальную бумагу Whatman 3 ММ и высушите его, пользуясь специальной сушкой для гелей. Выявите радиоактивную РНК методом радиоавтографии. В другом варианте гель можно окрасить перед сушкой бромистым этидием в концентрации 0,5 мкг/мл в течение 15 мин и выявить эндогенные ядерные РНК при освещении УФ-светом.

Большие РНК-транскрипты

1. Приготовьте 0,8%-ный агарозный гель в 10 мМ фосфате натрия, рН 7,0.

2. Растворите радиоактивную РНК в 1 ? деионизованном глиоксале3, 50%-ном ДМСО, 10 мМ фосфате натрия, рН 7,0, и инкубируйте при 50°С 1 ч4. На этой стадии РНК денатурирует.

3. Нанесите обработанную глиоксалем РНК на гель и проводите электрофорез-при 100 В, используя в качестве маркера бромфеноловый синий. Обеспечьте постоянную циркуляцию электродного буфера между катодной и анодной камерами, чтобы не допустить увеличения рН свыше 8,0, иначе РНК будет деглиоксалирована. Продолжайте электрофорез до тех пор, пока краска не пройдет две трети высоты геля5.

4. Выявите радиоактивную РНК методом радиоавтографии. Если при электрофорезе использовали маркерные РНК (например, 28S- и 18S-pPHK), то их можно увидеть после окрашивания геля бромистым этидием.

1 ТБЭ-буфер имеет состав: 50 мМ трис, 50 мМ борная кислота, 50 чкМ ЭДТА Скорость миграции тРНК составляет 80% скорости миграции ксиленцианола Приготовьте 3 ? глиоксаль (Sigma) в воде и деионизуйте его пропусканием череч-колонку (1 мл) со смолой Biorad AQ501-X8. Раствор для обработки глиоксалем имеет состав: 3 ? глиоксаль, 67%-ный ДМСО, 10 мМ фосфат натрия, рН 7,0.

4 Обработка РНК глиоксалем описана в работе [17].

5 тРНК мигрирует впереди бромфенолового синего.

4.2. Скорость элонгации

Среднюю скорость элонгации определить довольно легко методом, подробно описанным в табл. 9. С этой целью ядра инкубируют в течение короткого периода времени (0,5—1,0 мин) с

226

Глава 4

Таблица 9. Измерение скорости элонгации РНК

1. Внесите ядра в стандартную реакционную смесь для транскрипции (табл. 5), содержащую все четыре немеченых рибонуклеозидтрифосфата в обычных концентрациях и не содержащую меченый GTP.

2. Проинкубируйте 5 мин при нужной температуре.

3. Добавьте необходимое количество [a-32P]-GTP. Через 0,5—1,0 мин остановите реакцию добавлением десяти объемов 1%-ного ДСН, 10 мМ ЭДТА, ? ? 7,0.

4. Выделите РНК, как описано в пп. 1—6 табл. 6.

5. Растворите РНК в 0,5 мл 1%-ного ДСН, 1 мМ ЭДТА, рН 7,0 и проанализируйте ее путем центрифугирования в сахарозном градиенте, как описано в табл. 7. На этой стадии большие по размеру РНК (которые еще продолжают элонгироваться) отделяются от малых РНК (разд. 4.1). Объедините фракции градиента, содержащие РНК с размерами более 15S.

•6. Осадите собранную РНК этанолом (табл. 6, пп. 6 и 7).

7. Растворите РНК в 20 мкл 10 мМ ацетата натрия, рН 5,0. Добавьте по 1