0 ед. РНКазы Т1 (Sigma) и РНКазы Т2 (Sigma) и проинкубируйте при 37 °С 3 ч.

8. Нанесите гидролизат на хроматографическую бумагу Whatman 3 ММ (10X45 см) и на отдельную дорожку радиоактивные GMP и гуанозин в качестве маркеров. Высушите пятна феном.

9. Фракционируйте пробы методом восходящей хроматографии в смеси бу-тан-1-ол:0,1 ? хлорид аммония (6:1) 16 ч при комнатной температуре.

10. Высушите хроматографическую бумагу в вытяжном шкафу, после чего разрежьте ее поперек на полоски шириной 0,5 см.

11. Погрузите каждую полоску в 1 мл воды на 1 ч.

12. Отберите водные элюаты, добавьте по 10 мл тритон-толуольного сцинтил-лятора1 к каждому из них и просчитайте на счетчике. Определив положение маркеров GMP и гуанозина, определите радиоактивность того и другого в пробах РНК-транскриптов.

Длина РНК, образовавшейся при инкубации, определяется отношением радиоактивности в GMP к радиоактивности в гуанозине. Чтобы получить скорость элонгации, эту величину нужно разделить на время инкубации.

1 Смесь 13,5 г омнифлуора (???), 1 л тритона Х-100 и 2 л толуола.

[3H]-GTP или каким-либо другим [3Н]-нуклеозидтрифосфатом. РНК выделяют, расщепляют РНК-азами Т1 и Т2 и образующиеся нуклеотиды и нуклеозиды разделяют методом хроматографии на бумаге '[18]. Отношение радиоактивности в GMP к радиоактивности в свободном гуанозине определяет размеры РНК-транскрипта, синтезированного во время инкубации, и соответственно позволяет оценить скорость элонгации. Перед расщеплением небольшие РНК удаляют центрифугированием в сахарозном градиенте, так как они не входят в число новооб-разующихся транскриптов. В ядрах миеломы мыши [18] типичная скорость элонгации равна приблизительно 5 нуклеоти-дам/с. При такой скорости молекула 455-рРНК-предшественни-ка (длиной 10 000 нуклеотидов) должна полностью синтезироваться in vitro за 30 мин.

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

127

Ю 20 Номер фракции

Рис. 2. Синтез РНК в изолированных ядрах клеток миеломы мыши в течение 30 мин с использованием [a-32P]-GTP в качестве радиоактивного меченого предшественника. Затем РНК фракционировали в сахарозном градиенте, как описано в табл. 7. Градиентные профили относятся к РНК, синтезированной в условиях, описанных в табл. 5 (светлые кружки), и РНК, синтезированной в присутствии клеточного экстракта (темные кружки), как описано в разд. 6.4. В качестве маркеров использовали 28S- и 18S-pPHK (положения показаны стрелками).

Скорость синтеза РНК, определяемая по включению [a-32P]-GTP в ТХУ-нерастворимый материал (табл. 5, п. 3),составляет приблизительно 0,1—0,2 пмоля включенного GMP/мкг ДНК/мин, что соответствует 5—10% скорости in vivo. Вместе с тем скорость элонгации in vitro (5 нуклеотидов/с) составляет 20% скорости in vivo (25 нуклеотидов/с). Отсюда следует, что, по-видимому, не все молекулы РНК-полимеразы, инициировавшие РНК-транскрипты in vivo, одновременно участвуют в элонгации in vitro.

4.3. Инициация синтеза РНК

4.3.1. Использование [у-32Р]-нуклеозидтрифосфатов

Первичный транскрипт содержит на 5'-конце инициированной молекулы РНК структуру рррХр. Включение в РНК [у-32Р]-рибонуклеозидтрифосфата и сохранение радиоактивного ?-фосфата на 5'-конце обычно используют для измерения инициации цепей РНК in vitro >[2, 12] по методике, приведенной в табл. 10, А. Эта методика, с помощью которой регистрируют включение одного радиоактивного атома в один инициирован

128

Глава 4

ный транскрипт, наиболее эффективна при анализе коротких частей инициирующихся повторно транскриптов [2, 12], например 5S-PHK и тРНК. Она применима только в тех случаях, когда РНК-продукт сохраняет свой трифосфатный конец, т. е. не кэпируется.

4.3.2. Использование ?-тионуклеозидтрифоефатов

Использование [7-32Р]-рибонуклеозидтрифосфата для исследования инициации РНК по методу, упомянутому выше, зависит от возможности обнаружения единственного нуклеотида в новообразованной РНК, имеющего [32Р] в у-положении. Если изучаемая РНК очень длинная или in vitro инициируется недостаточно часто, анализ инициации транскрипции этим методом становится практически невозможным, поскольку уровень радиоактивности, соответствующий этой РНК, недостаточен для детектирования. Кроме того, ?-фосфат обычно быстро выводится из первичных транскриптов в таких сложных системах, как ядра, в результате кэпирования или действия фосфатаз.

Экштейн был первым, кто предложил использовать тиону-клеотиды в исследованиях метаболизма нуклеиновых кислот [19] и сам широко применял их при изучении стереохимии ферментативных реакций [20]. Мы решили применить [y-S]-рибонуклеозидтрифосфаты для специфического мечения РНК, инициируемой in vitro, которую затем можно выделить методом аффинной хроматографии на ртутьорганическом носителе, а именно на Hg-агарозе или Hg-целлюлозе ? [21, 22]. Использование такого аффинного мечения в сочетании с [а-32Р]-рибо-нуклеозидтрифосфатами позволяет выделять РНК, транскрибированную in vitro, с гораздо более высокой удельной активностью, чем при использовании [а-32Р]-рибонуклеозидтрифос-фатов. При этом устраняется конкуренция со стороны РНК, которая во время реакции транскрипции только элонгируется. К тому же [y-S]-нуклеотиды устойчивы к действию фосфатазы, а после включения в РНК препятствуют кэпированию [23]. Исследования с применением ингибирования а-аманити-ном показывают, что в ядрах миеломы мыши все три РНК-полимеразы могут утилизировать у-тиоаналоги [22]. Кроме того, было обнаружено, что скорость синтеза РНК обычно выше при использовании [y-S] -нуклеотидов, чем при использовании незамещенных нуклеотидов, по-видимому, благодаря более высокой стабильности первых, хотя это предположение еще нужно доказать. Таким образом, этот метод можно использовать для исследования продуктов транскрипции, синтезируемых с помощью эукариотических РНК-полимераз всех трех классов, в том числе мРНК и вирусных РНК '[22, 24].

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

129

Таблица 10. Исследование инициации синтеза РНК

A. Использование [у-32Р]-нуклеозидтрифосфатов'

1. Проинкубируйте ядра, как описано в табл. 5, добавив [y-32P]-GTP или [?-32?]-??? (1—5 мКи/мл; 200 Ки/ммоль).

2. Выделите РНК, как описано в табл. 6.

3. Растворите пробу РНК в 20 мкл 10 мМ ацетата натрия, рН 5,0. Добавьте по 10 ед. РНКазы TI (Sigma) и РНКазы Т2 (Sigma) и проинкубируйте 3 ч при 37 °С.

4. Если произошла инициация синтеза РНК, то после гидролиза РНКазами Т1 и Т2 метка [32Р] будет присутствовать в pppGp или рррАр. Эти радиоактивные тетрафосфаты могут быть обнаружены методом тонкослойной хроматографии на ???-целлюлозе с использованием в качестве элюирую-щего хроматографического раствора 1,5 ? КН2Р04, рН 3,5.

Б. Использование у-тионуклеозидтрифосфатов

1. Проинкубируйте ядра, как описано в табл. 5, добавив [?-SJ-GTP или [y-S]-ATP (Boehringer) вместо GTP или АТР2. Один или несколько из других трех нуклеозидтрифосфатов можно пометить [а-32Р]. Можно также использовать [?-S] [fi-32P]-GTP или [?-S] [?-32?]-??? [19, 20].

2. Выделите РНК, как описано в табл. 6, но для хроматографического разделения на сефадексе G50 или биогеле Р6 используйте 0,1%-ный ДСН, 0,1 ? NaCl, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 7,9 (табл. 6, п. 11).

3. После фракционирования на сефадексе G50 объедините фракции РНК, соответствующие свободному объему, и нанесите их на колонку, содержащую 1—2 мл Hg-агарозы или Hg-целлюлозы, которая предварительно уравновешена буфером, описанным в п. 2.

4. Промойте колонку с Hg-агарозой или Hg-целлюлозой десятью объемами буфера, состав которого приведен выше, в п. 2.

5. Элюируйте специфически связавшуюся РНК (?-S-PHK) 10 мМ ДТТ или 1%-ным 2-меркаптоэтанолом в этом же буфере. РНК, элюирующаяся при этих условиях, должна быть продуктом инициации in vitro.

B. Использование ?-тионуклеозидтрифосфатов Описано в работах [32, 33].

1 Поскольку радиоактивный фосфат включается в РНК-транскрипт только по 5'-кон-цу, этот способ исследования инициации применяют только в тех случаях, когда такие транскрипты составляют значительную часть конечного РНК-продукта (например, 5S рРНК или тРНК) н имеют на конце трифосфаты (т. е. не кэпированы).

г Чтобы показать, что сера действительно включается по 5'-концу РНК. добавьте в инкубационную смесь in vitro (табл. 5) ly S)[|1-3!P]-GTP или [y-SI3-"P]-ATP, затем выделите РНК (табл. 6) и проведите анализ распределения включившейся метки следующим образом. К РНК добавьте NaOH до конечной концентрации 0,3 ? и проинкубируйте пробу при 37 "С 18 ч для того, чтобы прошел гидролиз РНК. Выделите серусо-держащие нуклеотиды методом хроматографии на Hg-агарозе, как описано в пп. 3—5 табл. 10, Б. Добавьте к этим нуклеотидам 1 мг дрожжевой тРНК (предварительно расщепленной РНКазой) и хроматографируйте эту смесь на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в 1 мМ 2-меркаптоэтаноле, 7 ? мочевине, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0. Элюируйте нуклеотиды линейным градиентом 0,0-3—0,30 ? NaCl. Измерьте радиоактивность собранных фракций. При данных условиях нуклеозидтетрафосфат имеет общий заряд —6, и поэтому серусодержащие нуклеотиды, меченные 32Р, должны элюироваться вместе с ним.

Использование [y-SJ-рибонуклеозидтрифосфатов для анализа инициации синтеза РНК описано в табл. 10, Б. В качестве аффинного носителя для очистки РНК-транскриптов можно использовать Hg-агарозу или Hg-целлюлозу. Hg-агарозу готовят с использованием биогеля А-15М [25]. Чтобы свести к минимуму образование сшивок при активации геля, следует использовать низкую концентрацию бромциана (<10 мг/мл). Hg-ara-

9—953

130

Глава 4

розный гель, приготовленный путем активации с бромцианом (2,5 мг/мл), имеет высокую связывающую активность, и на нем одинаково хорошо идет отбор РНК всех размеров [21]. Приготовление Hg-целлюлозы описано в табл. 11.

Таблица 11. Приготовление Hg-целлюлозы

1. Проинкубируйте порошок целлюлозы в 5 ? NaOH в течение ночи при 4 °С в атмосфере азота.

2. Промойте целлюлозу на фильтре 100 объемами воды и затем 100 объемами 0,75 ? карбоната калия, рН 11,0.

3. Ресуспендируйте промытую целлюлозу в 0,75 ? карбонате калия, рН 11,0, до конечной концен